MANGER. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Il a été récemment démontré que le champignon ascomycète Ilyonectria crassa est capable d'infecter les tubercules de pomme de terre. Ce travail est le premier à analyser les caractéristiques biologiques et la résistance à certains fongicides de la souche I. crassa isolée à partir de pommes de terre. Les séquences de régions spécifiques à l'espèce de la souche «pomme de terre» coïncidaient avec celles obtenues précédemment pour les champignons isolés des racines de la jonquille, du ginseng, du tremble et du hêtre, des bulbes de lys et des feuilles de tulipe. Apparemment, de nombreuses plantes sauvages et de jardin peuvent être des réserves d'I. Crassa. La souche étudiée a infecté des tranches de tomate et de pomme de terre, mais n'a pas infecté le fruit entier de la tomate et le tubercule de pomme de terre intact. Cela montre que I. crassa est un parasite des plaies. L'évaluation de la résistance au fludioxonil, au difénoconazole et à l'azoxystrobine sur un milieu nutritif a montré une efficacité élevée de ces médicaments.
L'indice CE50 (la concentration du fongicide, qui ralentit de 2 fois le taux de croissance radiale de la colonie par rapport au contrôle fongicide) était égal à 0.4; 7.4 et 4 mg / l, respectivement. La possibilité de développement de la maladie causée par I. crassa doit être prise en compte lors de l'évaluation phytopathologique des tubercules de pomme de terre et de l'élaboration de mesures phytosanitaires.
Le développement de microorganismes phytopathogènes entraîne des pertes élevées à tous les stades de la culture et du stockage des pommes de terre. Lors de la planification des mesures de protection, en règle générale, des agents pathogènes bien connus sont pris en compte, tels que les espèces des genres Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. Cependant, ces dernières années, de plus en plus de rapports sont apparus sur l'apparition de nouveaux microorganismes phytopathogènes sur les pommes de terre. Leur biologie est mal étudiée, l'efficacité des fongicides utilisés sur les pommes de terre par rapport à eux est inconnue, les méthodes de diagnostic n'ont pas été développées. Avec un développement massif, ils sont capables de causer des dommages importants à la culture de pommes de terre. L'un de ces micro-organismes est le champignon ascomycète Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, découvert pour la première fois par les auteurs sur des tubercules de pomme de terre (Chudinova et al., 2019).
Ce travail présente les résultats de l'analyse de la souche I. crassa isolée à partir de tubercules de pomme de terre. La morphologie des colonies et des structures mycéliennes d'I. Crassa, les séquences nucléotidiques des régions d'ADN spécifiques à l'espèce, la virulence aux pommes de terre et aux tomates et la résistance à certains fongicides populaires ont été étudiées.
matériaux et méthodes
Nous avons utilisé la souche I. crassa 18KSuPT2 isolée en 2018 du tubercule de pomme de terre infecté cultivé dans la région de Kostroma. Le tubercule était affecté par un type de pourriture sèche avec une cavité recouverte de mycélium brun clair. A l'aide d'une aiguille de dissection stérile, le mycélium fongique a été transféré dans une boîte de Pétri avec un milieu gélosé (moût de bière 10%, agar 1.5%, pénicilline 1000 U / ml). Les plaques ont été incubées dans l'obscurité à 24 ° C.
Un microscope optique Leica DM2500 avec un appareil photo numérique ICC50 HD et un microscope binoculaire Leica M80 avec un appareil photo numérique IC80HD (Leica Microsystems, Allemagne) ont été utilisés pour photographier, évaluer la taille et la morphologie des spores et des organes de spores.
Pour isoler l'ADN, le mycélium fongique a été cultivé dans un milieu de pois liquide, puis congelé dans de l'azote liquide, homogénéisé, incubé dans du tampon CTAB, purifié avec du chloroforme et lavé deux fois avec de l'alcool à 2%.
La méthode d'extraction d'ADN est décrite en détail dans l'article de Kutuzova et al. (2017).
Pour déterminer l'espèce par des méthodes moléculaires et la comparer avec d'autres souches connues de I. crassa, la PCR a été réalisée avec des amorces qui ont permis l'amplification de régions d'ADN spécifiques à l'espèce: ITS1-5,8S-ITS2 (amorces ITS5 / ITS4, White et al., 1990), régions géniques b -tubuline (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) et facteur d'élongation de traduction la (tef1a) (amorces EF1-1F / EF728-1R, Carbone et Kohn, 986). Des amplicons de la longueur souhaitée ont été extraits du gel en utilisant le kit Evrogen CleanUp. Les régions amplifiées ont été séquencées en utilisant le kit de séquençage de cycle BigDye® Terminator v1999 (Applied Biosystems, CA, USA) sur un séquenceur automatisé Applied Biosystems 3.1 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Les séquences nucléotidiques résultantes ont été utilisées pour rechercher une correspondance dans la base de données GenBank du National Center for Biotechnology Information (NCBI) des États-Unis. L'analyse phylogénétique a été réalisée à l'aide du programme MEGA 3730 (Tamura et al., 6).
La détermination de la virulence a été effectuée sur des fruits verts entiers de tomate à gros fruits (variété Dubrava) et des tubercules de pomme de terre (variété Gala). De plus, pour simuler les dommages causés aux fruits et tubercules endommagés, nous avons utilisé des tranches des mêmes fruits et tubercules. Des tranches de tubercules ont été placées dans des chambres humides, qui étaient des boîtes de Pétri avec du papier filtre humide au fond. Une lame a été placée sur le papier, sur laquelle, à leur tour, des tranches de tubercules ou de fruits ont été placées. Des tubercules et des fruits entiers ont également été placés dans des récipients avec du papier filtre humide au fond. Au centre de la tranche (ou sur la surface intacte du tubercule ou du fruit), un morceau de gélose (5 x 5 mm) avec des hyphes fongiques a été placé après 5 jours de culture sur gélose au moût.
L'évaluation de la résistance des souches fongiques aux fongicides a été réalisée en laboratoire sur milieu nutritif gélosé. Nous avons étudié la sensibilité aux médicaments fongicides Maxim, KS (principe actif fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobine 250 g / l), Scor, EC (difénoconazole 250 g / l) (Catalogue d'État ..., 2020). L'évaluation a été réalisée en boîtes de Pétri sur milieu moût-agar avec addition des médicaments étudiés à des concentrations de la substance active 0.1; une; 1 ppm (mg / L) (pour le fludioxonil et le difénoconazole), 10; Dix; 1 ppm (pour l'azoxystrobine) et dans des milieux sans fongicide (contrôle). Le fongicide a été ajouté au milieu fondu et refroidi à 10 ° C, après quoi le milieu a été versé dans des boîtes de Pétri. Un bloc d'agar avec du mycélium fongique a été placé au centre d'une boîte de Pétri et cultivé à une température de 100 ° C dans l'obscurité. Après 60 jours d'incubation, les diamètres des colonies ont été mesurés dans deux directions perpendiculaires l'une à l'autre; les résultats des mesures pour chaque colonie ont été moyennés. Les expériences ont été réalisées en triple. Sur la base des résultats des analyses, la CE24 a été calculée, égale à la concentration du fongicide, qui a divisé par deux le taux de croissance radiale de la colonie par rapport au contrôle fongicide.
résultats et discussion
Sur des boîtes de Pétri avec de la gélose au moût, le champignon a formé des colonies avec du mycélium floculant blanc. Le milieu sous le mycélium est devenu brun rougeâtre. Lorsque le milieu sèche, le champignon forme des spores de deux types sur des conidiophores simples et agrégés dans de petites sporodochies. Les macroconidies sont allongées, cylindriques, avec un à trois septa, longueur moyenne 27.2 µm avec une gamme de valeurs de 23.2 à 32.2 µm, largeur - jusqu'à 4.9 µm (Fig. 1). La longueur moyenne des microconidies est de 14.3 µm avec une plage de valeurs de 10.3 à 18.1 µm, la largeur peut atteindre 4.0 µm. Tous les caractères macro et micromorphologiques s'inscrivent dans la gamme de variation de l'espèce Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Les séquences des régions d'ADN spécifiques aux espèces (ITS, b-tubuline, TEF 1α) coïncidaient complètement avec les séquences des souches de I. crassa que nous avons étudiées précédemment (Chudinova et al., 2019, tableau 1). Pour étudier la prévalence d'I. Crassa dans d'autres régions et pour analyser le spectre des cultures affectées, des séquences d'ADN analogues dans la base de données GenBank ont été analysées (tableau 1). Le chevauchement était de 86 à 100%. Les séquences des trois régions d'ADN de la souche I. crassa «pomme de terre» étaient identiques aux séquences des souches isolées du bulbe de lys et des racines de narcisse aux Pays-Bas et de la racine de ginseng au Canada. Nous n'avons pas réussi à trouver d'autres souches d'I. Crassa avec trois séquences similaires analysées dans des bases de données ouvertes. Cependant, l'analyse des séquences déposées de l'ITS et de la b-tubuline a montré la présence d'I. Crassa sur les feuilles de tulipe au Royaume-Uni. Des champignons ayant une séquence ITS similaire ont été identifiés dans l'analyse du mycobiote des racines de tremble au Canada et des racines de hêtre en Italie, des tubercules de pomme de terre en Arabie saoudite (tableau 1). Les résultats de cette étude montrent que I. crassa a une distribution mondiale et est capable d'infecter diverses espèces végétales.
Lors de la détermination de la pathogénicité sur des tranches de tomate et de pomme de terre le 5ème jour, le diamètre de la lésion a atteint 1.5 cm La souche étudiée n'a pas infecté le fruit entier de la tomate et le tubercule de pomme de terre intact. Cependant, les sépales ont été affectés sur la tomate. Pour exclure la possibilité de contamination par le mycélium développé sur la tranche de tubercule de pomme de terre, un isolat fongique a été isolé dans une culture pure. C'était complètement identique à la souche parentale. Apparemment, I. crassa est un parasite des plaies.
Le traitement pré-plantation des tubercules de semence avec des fongicides réduit le développement de maladies sur les plantes pendant la saison de croissance. Pour la sélection de fongicides efficaces, il est important d'évaluer lesquels d'entre eux sont efficaces contre I. сrassa. Les travaux ont étudié les substances actives répandues des fongicides - fludioxonil, azoxystrobine, difénoconazole. Le fludioxonil est inclus dans plusieurs mélanges utilisés pour habiller les graines et les tubercules avant la plantation. Le fludioxonil (Maxim) est également utilisé pour traiter les tubercules de semence avant stockage. Le difénoconazole et l'azoxystrobine sont également inclus dans un certain nombre de préparations utilisées pour le traitement du matériel de semence, ainsi que dans les préparations destinées au traitement des plantes végétatives (catalogue d'État ..., 2020).
La vitesse de croissance de I. crassa a été étudiée sur des milieux (Fig.2) avec différentes concentrations de substances actives: fludioxonil (CE50 = 0.4 ppm), azoxystrobine (CE50 = 4 ppm) et difénoconazole (CE50 = 7.4 ppm) (Tableau 2). Ces préparations peuvent être considérées comme très efficaces contre I. crassa, car leur CE50 est nettement inférieure à la concentration recommandée de la préparation dans le fluide de travail utilisé pour le traitement des tubercules. Selon le catalogue d'État ... (2020), la concentration de fludioxonil dans le liquide de traitement des tubercules de pomme de terre est de 500 à 1000 ppm, azoxystrobine (dans le liquide pour traiter le fond du sillon) - 3750-9375 ppm, difénoconazole (dans le liquide de traitement des plantes végétatives) - 187.5– 625 ppm.
Tableau 1. Similitude de séquence des séquences spécifiques à l'espèce de la souche 18KSuPT2 et des souches Ilyonectria crassa disponibles dans la base de données Genbank
Souche | Plante hôte, site d'excrétion | Numéros de séquence déposés dans GenBank, pourcentage de similitudes | Lien | ||
SES | β-tubuline | TEF1α | |||
17KSPT1 et 18KSuPT2 | Tubercule de pomme de terre, région de Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, ce travail |
SCS 158/31 | Racines de narcisse, Pays-Bas | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et coll., 2012 |
SCS 139/30 | Bulbe de lis, Pays-Bas | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Racine de ginseng, Canada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Feuille de tulipe, Royaume-Uni | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Sd | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Racines de tremble, Canada | MT294410 100 | Sd | Sd | Ramsfield et coll., 2020 |
ER1937 | Beech, Italie | KR019363 99.65 | Sd | Sd | Tizzani, Haegi, Motta. Soumission directe |
KAUF19 | Tubercule de pomme de terre, Arabie Saoudite | HE649390 98.3 | Sd | Sd | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = non déposé
Tableau 2. Résistance d'Ilyonectria crassa aux fongicides
(substance active) | CE50, ppm | ||||
jour 3 | jour 5 | jour 7 | |||
Contrôler | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobine) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difénoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Dans nos travaux, des souches d'I. Crassa ont été isolées à partir de tubercules de pomme de terre dans les régions de Kostroma et de Moscou (Chudinova et al., 2019). Une proportion élevée de souches fongiques avec des séquences ITS identiques à I. crassa a été révélée lors de l'analyse du mycobiote des tubercules de pomme de terre en Arabie saoudite (Gashgari et Gherbawy, 2013). Apparemment, I. crassa n'est pas aussi rare sur les pommes de terre que cela puisse paraître. Nos expériences ont montré que le champignon pouvait infecter les fruits de tomates endommagés. Il est connu de la littérature que I. crassa est capable de se développer de manière saprotrophique dans le sol (Moll et al., 2016), ainsi que d'affecter une variété de plantes, même taxonomiquement éloignées comme les jonquilles, les lys, le ginseng, le tremble et le hêtre (tableau 1). une). Apparemment, de nombreuses plantes sauvages et de jardin peuvent être des réserves d'I. Crassa. Ce qui précède montre que lors de l'élaboration de mesures de protection, il est nécessaire de prendre en compte la possibilité d'affecter les tubercules de pomme de terre avec ce champignon. Des préparations répandues pour le traitement des tubercules de pomme de terre contenant du fludioxonil, de l'azoxystrobine et du difénoconazole ont montré une efficacité fongicide élevée contre I. crassa.
Ce travail a été soutenu par la Fondation russe pour la recherche fondamentale (subvention n ° 20-016-00139).
L'article a été publié dans la revue "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)