D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Le champignon phytopathogène Colletotrichum coccodes provoque des maladies dangereuses chez les pommes de terre et les tomates appelées anthracnose et tache noire des tubercules. Par leurs caractéristiques morphologiques, ils sont souvent difficiles à distinguer des maladies causées par d'autres microorganismes; sur les fruits de tomates vertes, la maladie peut être asymptomatique et ne se manifester que sur les fruits rouges mûrs. Pour un diagnostic rapide et précis de l'agent pathogène, un système de test PCR en temps réel est proposé. Pour mettre au point un système d'essai, la séquence nucléotidique du gène de la glycérol triphosphate déshydrogénase de souches de 45 C. coccodes isolées à partir de tubercules de pomme de terre dans différentes régions de Russie a été déterminée.
Sur la base des résultats obtenus et de l'analyse de séquences similaires d'autres espèces disponibles dans la base de données GenBank, les amorces spécifiques à l'espèce et la sonde pour C. coccodes ont été conçues. Pour vérifier la spécificité du système de test créé, une PCR a été réalisée avec de l'ADN isolé de cultures pures de 15 espèces différentes de champignons parasites et saprotrophes associés aux plants de tomates et de pommes de terre (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). La présence d'ADN de Colletotrichum coccodes a été déterminée à un cycle seuil de 20 à 27, tandis que d'autres espèces ont été détectées après 40 cycles ou n'ont pas été détectées. Le système de test permet de détecter de manière fiable des concentrations d'ADN de C. coccodes supérieures à 0.01 ng / mm3 dans le mélange PCR analysé. En utilisant le système de test développé, la présence de C. coccodes dans les feuilles de tomate présentant des symptômes de maladies fongiques et dans les tubercules de pomme de terre sans symptômes externes de la maladie a été étudiée. Des feuilles présentant des symptômes d'infection fongique ont été collectées dans deux champs différents du territoire de Krasnodar, des tubercules - dans des champs des régions de Kostroma, Moscou, Kaluga et Nizhny Novgorod. Une feuille de tomate contenant de l'ADN de C. coccodes a été trouvée dans le territoire de Krasnodar; une présence significative d'ADN de ce pathogène a été détectée dans 5 échantillons de tubercules cultivés dans les régions de Kostroma, Moscou, Kaluga.
introduction
Les champignons du genre Colletotrichum sont des phytopathogènes dangereux affectant les céréales, les légumes, les herbes, les fruits vivaces et les baies. L'une des espèces omniprésentes de ce genre, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, est l'agent causal de l'anthracnose et de la tache noire des pommes de terre et des tomates, et provoque des maladies d'un certain nombre d'autres plantes de la famille des solanacées, incl. mauvaises herbes (Dillard, 1992). C. coccodes affecte toutes les parties souterraines de la plante, les bases des tiges, les feuilles et les fruits (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Sur la pelure des tubercules de pomme de terre infectés, on observe le développement de taches grises aux bords indistinctement prononcés, sur lesquels des points noirs de sporulation et de microsclérotes sont clairement visibles. Pendant le stockage, des ulcères au contenu ramolli peuvent se former dans la pulpe des tubercules, c.-à-d. la maladie entre dans la phase anthracnose, ce qui est cependant extrêmement rare.
Dans le même temps, les symptômes de l'anthracnose (ulcères cutanés avec de petits points noirs) sont typiques des tomates. Sur les feuilles, les symptômes de C. coccodes apparaissent sous forme de taches brun foncé, généralement bordées de tissu jaune (Johnson, 1994).
Le développement de taches noires sur les tubercules gâche leur apparence, ce qui est particulièrement prononcé lors de la vente de pommes de terre à pelure rouge lavées. L'exfoliation par pelage entraîne une évaporation excessive et une augmentation des pertes de stockage (Hunger, McIntyre, 1979). Les dommages causés à d'autres organes végétaux entraînent des pertes de rendement, qui ont été notées à la fois en terrain découvert et en terrain clos (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Les maladies causées par C. coccodes sont courantes dans presque toutes les régions productrices de pommes de terre du monde, y compris la Russie (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Le contrôle de ces maladies est difficile en raison de l'efficacité insuffisante des fongicides existants contre C. coccodes et du manque de variétés résistantes (Read, Hide, 1995).
L'inoculum de C. coccodes peut persister dans les tubercules de semence (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), les graines de tomates (Ben-Daniel et al., 2010), survivre longtemps dans le sol, sur les débris végétaux (Dillard, 1990) ; Dillard, Cobb, 1993) et dans les mauvaises herbes (Raid, Pennypacker, 1987). Les travaux de plusieurs auteurs (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) ont montré que le développement de la maladie chez les pommes de terre et les tomates dépend en grande partie de la présence d'inoculum dans les semences et sol. Par conséquent, pour minimiser les pertes dues à la maladie, il est nécessaire de diagnostiquer (y compris quantitativement) les propagules du champignon dans le matériel de semence, dans le sol, dans les tubercules de pommes de terre de semence et les graines de tomates mises au stockage. Les diagnostics morphologiques dans le sol et le matériel végétal ne peuvent être effectués que par la présence de microsclérotes, qui, cependant, se retrouvent également dans d'autres types de champignons.
Les symptômes sur les tubercules sont très similaires à la gale argentée causée par le champignon Helminthosporium solani. L'isolement de Colletotrichum coccodes et d'Helminthosporium solani dans une culture pure est assez difficile et prend beaucoup de temps en raison de la croissance lente sur un milieu nutritif. Pour identifier rapidement les coccodes de Colletotrichum, il est nécessaire d'utiliser des méthodes de diagnostic instrumentales. La méthode la plus pratique est la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et sa modification - la PCR en temps réel. Actuellement, un système de test développé par des chercheurs britanniques (Cullen et al., 2002) pour la région ITS1 de l'ADNr est utilisé en Europe et aux États-Unis. Son utilisation a donné de bons résultats dans l'analyse des isolats russes (Belov et al, 2018). Cependant, C. coccodes est très variable et sa détection à partir d'une séquence d'ADN peut conduire à des résultats faussement négatifs. Pour un diagnostic plus fiable, il est nécessaire d'analyser plusieurs séquences d'ADN spécifiques à l'espèce, dans le cadre desquelles nous avons développé un système de test original qui permet d'identifier C. coccodes par la séquence du gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase.
matériaux et méthodes
Pour évaluer l'efficacité et la spécificité des systèmes de test créés, nous avons utilisé des cultures pures de 15 espèces de champignons isolées par les auteurs à partir d'échantillons malades de feuilles et de fruits de tomates, de tubercules de pommes de terre (tableau 1). Pour l'isolement, nous avons prélevé des organes de plantes présentant des symptômes d'infection fongique, pas plus d'un organe par buisson.
Une tranche de tubercule avec une peau, une tranche de tomate et une feuille affectée ont été placées sous un microscope binoculaire, après quoi le mycélium, les spores ou un morceau de tissu ont été transférés sur un milieu gélose (gélose au moût) dans une boîte de Pétri avec une aiguille à dissection affûtée. Les isolats ont été conservés sur gélose inclinée dans des tubes à essai à 4 ° C.
Des échantillons de feuilles de tomates présentant des symptômes de maladies fongiques, destinés à l'analyse, immédiatement après la collecte (sur le terrain) ont été placés dans de l'alcool éthylique à 70% dans lequel ils ont été conservés jusqu'à l'isolement de l'ADN. Les tubercules de pomme de terre ont été livrés au laboratoire, pelés (morceau de 2 × 1 cm) et congelés à –20 ° С. Stocké congelé jusqu'à l'isolement de l'ADN.
Des cultures pures de champignons pour l'isolement d'ADN ont été cultivées dans un milieu de pois liquide. Le mycélium du champignon a été retiré du milieu liquide, séché sur papier filtre, congelé dans de l'azote liquide, homogénéisé, incubé dans du tampon CTAB, purifié avec du chloroforme, précipité avec un mélange d'isopropanol et d'acétate de potassium 0.5 M, lavé deux fois avec de l'alcool à 2%. L'ADN résultant a été dissous dans de l'eau désionisée et conservé à –70 ° C (Kutuzova et al., 20). La concentration d'ADN a été mesurée en utilisant un kit de quantification d'ADN HS pour l'ADN double brin sur Qubit 2017 (Qiagen, Allemagne). Les échantillons alcoolisés et congelés ont été triturés dans de l'azote liquide, puis une extraction d'ADN a été réalisée comme décrit ci-dessus (pour le mycélium des cultures fongiques pures).
Tableau 1. Origine des souches de champignons utilisées
Nom du champignon | Plante, orgue | Lieu de sélection |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubercule de pomme de terre | Région de Kostroma, tubercules de pomme de terre de 1ère génération au champ, cultivar Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | feuille de pomme de terre | représentant Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tubercule de pomme de terre | Région de Magadan, pos. Tente, tubercule de pomme de terre |
Cladosporium fulvum | feuille de tomate | Région de Moscou, tomate à gros fruits |
Alternaria tomatephila | tomate fruit | présenté par le personnel du laboratoire de mycologie et de phytopathologie de l'Institut panrusse de recherche sur la protection des végétaux |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomate fruit | Territoire de Krasnodar, district de Krymsky, catégorie Cream |
Fusarium oxysporum | racine de blé | Région de Moscou. |
La PCR a été réalisée sur un amplificateur DTprime (DNA-Technology). Pour la PCR, des amorces originales et une sonde pour la région spécifique à l'espèce du gène de la glycérol triphosphate déshydrogénase ont été utilisées: amorce directe Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, amorce inverse Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Les amorces amplifient une région de 213 pb.
La réaction a pris 50 ng d'ADN total (lors de l'analyse des feuilles et des tubercules) et 10 ng (lors de l'analyse de l'ADN de cultures pures de champignons). Le mélange réactionnel (35 μl) a été séparé par une couche de paraffine en deux parties: celle du bas (20 μl) contenait 2 μl de tampon de réaction 10x (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM de chaque désoxynucléotide triphosphate, 7 pmol de chaque amorce et 4 pmol d'une sonde fluorescente hydrolysable; celui du haut contenait 1 µl de tampon PCR 10 × et 1 U de Taq polymérase.
La séparation du mélange avec de la paraffine permet de conserver longtemps les tubes à une température de 5 ° C et de fournir un démarrage à chaud pour la PCR après les avoir chauffés pendant 10 min à une température supérieure à 80 ° C. La PCR a été réalisée selon le programme suivant: 94.0 ° C - 90 s (1 cycle); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cycles); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cycles); 10.0 ° C - stockage.
résultats et discussion
Les séquences du gène de la glycérol triphosphate déshydrogénase ont été déterminées dans 45 souches isolées de feuilles, de tiges, de tubercules de pomme de terre et de tomates (Kutuzova, 2018) dans différentes régions de Russie. Les séquences étudiées de toutes les souches ont été divisées en 2 groupes différant par deux nucléotides. Les séquences nucléotidiques des représentants des deux groupes sous les numéros KY496634 et KY496635 sont déposées dans GenBank.
Les amorces coc70gdf, coc280gdr et la sonde cocgdz conçues sur leur base ont été vérifiées à l'aide du programme BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) sur toutes les séquences du gène de la glycérol triphosphate déshydrogénase d'espèces du genre Colletotrichum et d'autres organismes disponibles dans la base de données GenBank.
Aucune région d'ADN d'autres organismes hautement homologues aux amorces et à la sonde n'a été trouvée.
La sensibilité du système de test a été vérifiée à l'aide d'échantillons avec différentes concentrations d'ADN de C. coccodes, d'ADN d'une feuille de pomme de terre infectée par l'anthracnose (collecté en 2017 à Mari El, variété Red Scarlett) et de pelures de tubercules atteints de tache noire (collectés dans la région de Kostroma, variété Red Scarlett, tableau 2). Pour confirmer la présence d'ADN dans les tubercules et les feuilles de pomme de terre, des souches de C. coccodes en ont été isolées dans des cultures pures.
Les résultats de l'analyse de sensibilité du système de test montrent qu'il peut être utilisé pour diagnostiquer avec succès la présence d'ADN de C. coccodes dans un échantillon lorsque sa teneur totale dans le mélange PCR est supérieure à 0.05 ng. Ceci est tout à fait suffisant pour la détection, puisqu'une sclérote contient en moyenne 0.131 ng et une spore contient environ 0.04 ng d'ADN (Cullen et al., 2002). Le système de test développé par le groupe anglais (Cullen et al., 2002) a montré une sensibilité similaire (cycle seuil 34 à 0.05 ng d'ADN et 37 à 0.005 ng).
L'analyse d'échantillons naturels contenant C. coccodes dans tous les cas a permis de révéler de manière fiable sa présence dans l'échantillon (tableau 2). La méthode proposée pour l'isolement de l'ADN était également applicable pour l'analyse d'échantillons de plantes naturelles.
Tableau 2. Détermination de la sensibilité du système d'essai proposé pour l'identification des coccodes Colletotrichum pour la PCR en temps réel
Sample | Quantité d'ADN dans l'échantillon *, ng | Cycle de seuil | Détection de C. coccodes |
---|---|---|---|
Mycélium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Pelure de tubercule 1 | 50 | 32 | + |
Pelure de tubercule 2 | 50 | 30 | + |
Pelure de tubercule 3 | 50 | 31.5 | + |
Feuille de pomme de terre | 50 | 29.5 | + |
Remarque. * Dans un mélange de produits PCR.
La spécificité du système de test a été testée sur des échantillons d'ADN extraits de 15 espèces de champignons. Toutes les souches de champignons ont été isolées par les auteurs à partir de fruits et de feuilles de tomate et de tubercules de pomme de terre atteints et sains; une souche a été isolée de la racine de blé (tableau 1). Parmi les espèces isolées de la surface du fruit, il existe également des espèces qui ne sont pas pathogènes pour la tomate (par exemple, Phellinus ferrugineovelutinus).
Des études ont montré que l'ADN de C. coccodes a été détecté à un cycle seuil de 20 à 27, tandis que d'autres espèces fongiques n'ont pas été détectées ou ont donné un signal après le cycle 40, ce qui peut être attribué à un effet de bruit non spécifique (tableau 3).
Tableau 3. Vérification du système de test pour différents types de champignons
Nom du champignon | Cycle de seuil |
Coccodes Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. cocodes 2 | 22.6 |
C. cocodes 3 | 23 |
C. cocodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatephila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Vésicarium Stemphylium | > 40 |
Ilionectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontie luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Remarque. * La quantité d'ADN dans tous les échantillons était de 10 ng.
Le système d'essai mis au point a été utilisé pour identifier C. coccodes dans des échantillons de feuilles de tomate présentant des symptômes d'agents pathogènes nécrotrophes et des tubercules de pommes de terre de semence sans symptômes visibles. Pour l'étude, nous avons pris des tubercules de semences de différentes variétés cultivées dans les régions de Kostroma, Moscou, Kaluga et Nizhny Novgorod. La présence d'ADN de C. coccodes a été considérée comme significative dans les échantillons, dans l'analyse desquels le cycle seuil ne dépassait pas 35. Cette valeur seuil a été choisie en fonction de la détermination fiable de 0.05 ng d'ADN de C. coccodes (cycle seuil 33.5, tableau 2) et du fait à des cycles de seuil supérieurs à 40, l'ADN non spécifique de certaines autres espèces fongiques a été diagnostiqué. Avec cette approche, la présence significative d'ADN de C. coccodes a été détectée dans 5 échantillons de tubercules cultivés dans les régions de Kostroma, Moscou, Kaluga et dans une feuille de tomate du district de Yeisk de la région de Krasnodar (tableaux 4, 5).
Tableau 4. Détection des coccodes Colletotrichum sur tubercules de pomme de terre *
Numéro d'échantillon | Variété de pommes de terre | Lieu de croissance | Détection de C. coccodes | Cycle de seuil |
---|---|---|---|---|
1 | Rouge écarlate | Région de Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Région de Moscou. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Joukovski au début | Région de Moscou. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | région de Kalouga. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Фантазия | région de Kalouga. | - | |
15 | Gala | région de Nijni-Novgorod. | - | |
16 | - |
Remarque. * La quantité d'ADN dans tous les échantillons était de 50 ng.
Tableau 5. Détection des coccodes Colletotrichum sur les feuilles de tomate *
Numéro d'échantillon | Lieu de croissance | Détection de C. coccodes | Cycle de seuil |
---|---|---|---|
1 | Territoire de Krasnodar, district de Crimée | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Territoire de Krasnodar, district de Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* La quantité d'ADN dans tous les échantillons était de 50 ng.
Le système de test que nous avons créé n'est pas inférieur à celui développé par des chercheurs britanniques (Cullen et al., 2002) en sensibilité et en spécificité et convient à l'analyse d'échantillons de plantes. Son application à l'analyse des tubercules de semence a permis d'identifier l'ADN de C. coccodes dans les tubercules sans signes extérieurs de dommage et d'analyser avec succès l'infection des feuilles.
À ce jour, aucune analyse des tubercules de pomme de terre pour l'infestation de C. coccodes n'a été réalisée en Russie. Notre première étude a montré que sur 16 tubercules testés cultivés dans différentes régions de la Fédération de Russie, 5 contenaient C. coccodes. Cela montre que la tache noire des tubercules de pomme de terre est une maladie courante de la pomme de terre en Russie et que son rôle dans la réduction du volume et de la qualité de la culture de pomme de terre est sous-estimé.
L'analyse des feuilles de tomate a révélé une présence significative d'ADN de C. coccodes dans une feuille du district de Yeisk du territoire de Krasnodar. Auparavant, lors de l'examen des champs de tomates dans le sud de la Russie à l'aide du système de test britannique (Cullen et al., 2002), des feuilles contenant C. coccodes ont été trouvées, et dans certains champs une forte proportion de feuilles infectées par C. coccodes a été trouvée (Belov et al., 2018). Dans les territoires de Krasnodar et Primorsky, la région de Moscou, nous avons trouvé des fruits de tomate, à partir desquels nous avons réussi à isoler des cultures pures de C. coccodes. Il est possible que C. coccodes soit beaucoup plus répandu sur la tomate en Russie qu'on ne le pense actuellement, et sa nocivité est également sous-estimée.
Ainsi, à ce jour, suffisamment d'informations ont été accumulées sur la distribution généralisée de C. coccodes sur les pommes de terre et les tomates.
Pour mieux comprendre le rôle de ce champignon dans le développement des maladies de la pomme de terre et de la tomate, il est nécessaire de surveiller sa prévalence en Russie, d'étudier le rôle des infections des sols et des semences, et le rôle de la tache noire dans les pertes lors du stockage. L'utilisation de diagnostics PCR peut considérablement faciliter ce travail, et l'utilisation simultanée des deux systèmes de test augmentera considérablement la précision de l'analyse.
Ce travail a été financé par une subvention de la Fondation scientifique russe n ° 18-76-00009.
L'article a été publié dans la revue "Mycology and Phytopathology" (volume 54, n ° 1, 2020).