S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
introduction
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - l'agent causal du mildiou, la maladie la plus importante du point de vue économique des pommes de terre et des tomates - a attiré l'attention de chercheurs de différents pays depuis plus d'un siècle et demi. Apparue soudainement en Europe au milieu du XIXe siècle, elle a provoqué une épidémie de pomme de terre qui est restée dans la mémoire de nombreuses générations.
Jusqu'à présent, on l'appelle souvent le "champignon de la faim irlandaise". Près de cent ans après les premières épidémies, des espèces de pommes de terre mexicaines sauvages résistantes au mildiou ont été découvertes, des méthodes de croisement avec des pommes de terre cultivées ont été développées (Muller, 1935) et les premières variétés résistantes au mildiou ont été obtenues (Pushkarev, 1937). Cependant, peu de temps après le début de leur culture commerciale, des races du pathogène du mildiou qui étaient virulentes à des variétés résistantes se sont accumulées. et l'introduction de nouveaux gènes de résistance de pommes de terre sauvages mexicaines dans des variétés a commencé à perdre rapidement de son efficacité.
Les échecs liés à l'utilisation de la résistance monogénique (verticale) ont forcé les sélectionneurs à rechercher des moyens plus complexes d'exploiter la résistance polygénique (horizontale) non spécifique. Ces dernières années, des races très agressives ont commencé à s'accumuler dans les populations individuelles du parasite, provoquant une érosion de la résistance même non spécifique. L'avènement de souches résistantes aux fongicides a posé des problèmes dans l'utilisation des produits chimiques de protection de la pomme de terre.
En raison des différences significatives entre les oomycètes et les champignons dans la composition chimique, l'ultrastructure et le métabolisme, les fongicides, en particulier les fongicides systémiques utilisés pour protéger les plantes de nombreuses maladies fongiques, sont inefficaces contre les oomycètes.
Par conséquent, dans la protection chimique contre le mildiou, des pulvérisations multiples (jusqu'à 12 fois par saison ou plus) avec des préparations de contact d'un large spectre d'action ont été utilisées. Une étape révolutionnaire a été l'utilisation de phénylamides, qui sont toxiques pour les oomycètes et se propagent de manière systémique dans les plantes. Cependant, leur utilisation généralisée a rapidement conduit à l'accumulation de souches résistantes dans les populations de champignons (Davidse et al., 1981), ce qui a considérablement compliqué la protection des plantes. P. infestans est pratiquement le seul parasite de la zone tempérée, dont les dommages en agriculture biologique ne peuvent être neutralisés sans l'utilisation de moyens de protection chimiques (Van Bruggen, 1995).
Ce qui précède explique la grande attention que les chercheurs de différents pays accordent à l'étude des populations de P. infestans, à la dynamique de leur abondance et de leur composition génétique, ainsi qu'aux mécanismes génétiques de variabilité.
Cycle de vie de R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans développe un mycélium intercellulaire avec haustoria à l'intérieur des feuilles de pomme de terre. Se nourrissant des tissus foliaires, il provoque la formation de taches sombres qui deviennent noires et pourrissent par temps humide. Avec une forte défaite, la feuille entière meurt. Après une période d'alimentation, des excroissances se forment sur le mycélium - les sporangiophores - qui poussent vers l'extérieur à travers les stomates. Par temps humide, ils forment une fleur blanche autour des taches sur la face inférieure des feuilles. Aux extrémités des sporangiophores, se forment des zoosporanges en forme de citron, qui se détachent et sont transportés par les embruns (Fig.1). Tombant en gouttes d'eau à la surface d'une feuille de pomme de terre, les sporanges germent avec 6-8 zoospores qui, après une période de mouvement, sont arrondis, recouverts d'une coquille et germent avec un tube germinatif. La pousse pénètre à travers les stomates dans le tissu foliaire. Dans certaines conditions, les sporanges peuvent se développer dans un tube de croissance directement dans le tissu foliaire. Dans des conditions favorables, le délai entre l'infection et la formation d'une nouvelle sporulation n'est que de 3 à 4 jours.
Une fois au sol et filtrés à travers le sol, les sporanges sont capables d'infecter les tubercules. Les tubercules gravement atteints pourrissent pendant le stockage; chez les personnes faiblement atteintes, l'infection peut persister jusqu'à la saison suivante. De plus, l'agent causal du mildiou peut persister en hiver sous forme d'oospores (spores sexuelles au repos à paroi épaisse) dans le sol sur les débris végétaux et sur les graines de tomates. Les oospores se forment sur les organes vivants des plantes lorsque des souches de différents types d'accouplement rencontrent une humidité excessive. Au printemps, la sporulation asexuée se forme sur les tubercules infectés plantés et sur les résidus végétaux contenant des oospores; les zoospores pénètrent dans le sol et provoquent une infection des feuilles inférieures des plantes. Dans certains cas, le mycélium peut se développer à partir du tubercule infecté le long de la partie verte de la plante et apparaître généralement dans la partie supérieure de la tige.
Une différence significative entre les oomycètes et la plupart des champignons réside dans la prédominance de la diplophase dans leur cycle de vie avec méiose gamétique et germination des zygotes (oospores) sans fission nucléaire réductrice. Cette particularité, ajoutée à l'hétérotallisme dipolaire remplaçant la bisexualité, semble permettre d'appliquer aux oomycètes les approches développées pour étudier les populations d'eucaryotes supérieurs (analyse de la panmixie et subdivision des populations, flux génétiques intra et interpopulation, etc.). Cependant, trois facteurs ne permettent pas de transférer complètement ces approches dans l'étude des populations de P. infestans.
1. Parallèlement aux oospores hybrides, des oospores autofertiles et parthénogénétiques se forment dans les populations (Fife et Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), et la fréquence de leur formation peut être suffisante pour influencer sur les résultats du test.
2. Le processus sexuel chez P. infestans apporte une contribution insignifiante à la dynamique de la taille de la population, car le champignon se reproduit principalement par spores végétatives, formant pour plus de 90% des résultats de l'analyse du type d'accouplement par la méthode traditionnelle sur un milieu nutritif ... la saison de croissance plusieurs générations de sporulation asexuée (développement de la maladie polycyclique). Les oospores jouent un rôle important dans la préservation de l'organisme pendant la période où il n'y a pas de plantes vertes (en hiver) et dans la primo-infection des semis. Puis, au cours de l'été, il se produit une reproduction clonale et une augmentation ou, au contraire, une diminution du nombre de clones individuels nés de la recombinaison sexuelle, qui est principalement déterminée par la sélection des plus adaptés. Par conséquent, le rapport des clones individuels dans une population au début et à la fin des épiphytotiques peut être complètement différent.
3. Le cycle décrit est caractéristique des populations indigènes de P. infestans dans leur patrie, l'Amérique centrale. Dans d'autres régions du monde, le processus sexuel n'était pas connu depuis plus de 100 ans; le mycélium végétatif dans les tubercules de pomme de terre infectés était le stade de l'hivernage. Le cycle de vie était complètement agamique et la propagation était de nature focale: l'infection par des tubercules plantés infectés uniques passait aux feuilles, formant des foyers primaires de la maladie, qui pourraient fusionner avec le développement massif de la maladie.
Ainsi, dans certaines régions, il peut y avoir une alternance de cycles sexuels et asexués, tandis que dans d'autres - seulement un cycle asexué.
Origine de P. INFESTANS
P. infestans est apparu en Europe à la fin de la première moitié du XIXe siècle. Étant donné que la pomme de terre est originaire du nord-est de l'Amérique du Sud, on a supposé que le parasite avait été amené de là en Europe pendant le boom du salpêtre chilien. Cependant, des études menées à la station de pommes de terre du Rockefeller Center dans la vallée de Toluca, au Mexique, ont obligé à revoir ce point de vue (Niederhauser, 1991, 1993).
1. Dans la vallée de Toluca, les espèces locales de pommes de terre tubéreuses (Solanum demissum, S. bulbocastanum, etc.) ont différents ensembles de gènes de résistance verticale combinés à un niveau élevé de résistance non spécifique, ce qui indique une longue co-évolution avec le parasite. Les espèces sud-américaines, y compris les pommes de terre de culture, manquent de gènes de résistance.
2. Dans la vallée de Toluca, on trouve des isolats avec les types d'accouplement A1 et A2, ce qui fait que la population croisée de P. infestans est largement répandue; tandis que dans le pays natal des pommes de terre cultivées, en Amérique du Sud, le parasite se propage par clonage.
3. Dans la vallée de Toluca, il y a des épidémies annuelles sévères de mildiou. Par conséquent, parmi les chercheurs nord-américains (Cornell University), l'opinion sur la Méso-Amérique (Amérique centrale) comme berceau du phytophthora de la pomme de terre est établie (Goodwin et al., 1994).
Les chercheurs sud-américains ne partagent pas cette opinion. Ils croient que la pomme de terre cultivée et son parasite P. infestans ont une patrie commune - les Andes sud-américaines. Ils ont soutenu leur point de vue par des études moléculaires sur l'analyse des polymorphismes de l'ADN du génome mitochondrial (ADNmt) et des gènes nucléaires RAS et β-tubuline (Gomez-Alpizar et al., 2007). Ils ont montré que les souches collectées dans différentes parties du monde descendaient de trois lignées ancestrales divergentes, qui (toutes les trois) se trouvent dans les Andes sud-américaines. Les haplotypes andins sont les descendants de deux lignées: les isolats de la plus ancienne lignée d'ADNmt se trouvent sur des solanacées sauvages de la section Anarrhicomenum en Équateur, tandis que les isolats de la deuxième lignée sont communs sur les pommes de terre, les tomates et les morelles sauvages. A Toluca, même les haplotypes rares sont issus d'une seule lignée, la variabilité génétique des souches de Toluca (faible fréquence allélique de certains sites variables) indiquant un fort effet fondateur dû à une dérive récente.
De plus, une nouvelle espèce P. andina a été trouvée dans les Andes, morphologiquement et génétiquement similaire à P. infestans, qui, selon les auteurs, désigne les Andes comme un point chaud de spéciation dans le genre Phytophthora. Enfin, en Europe et aux États-Unis, les populations de P. infestans comprennent les deux lignées andines, tandis qu'à Toluca une seule.
Cette publication a suscité une réponse d'un groupe de chercheurs de différents pays, qui ont fait de nombreux travaux expérimentaux pour réviser l'étude précédente (Goss et al., 2014). Dans ce travail, premièrement, des séquences d'ADN microsatellites plus informatives ont été utilisées pour étudier les polymorphismes d'ADN; deuxièmement, pour l'analyse des regroupements, des trajectoires de migration, des temps de divergence des populations, etc. des modèles plus avancés ont été utilisés (statistiques F, approximations bayésiennes, etc.) et, troisièmement, une comparaison a été utilisée non seulement avec l'espèce andine P. andina, dans laquelle une nature hybride a été établie (P. infestans x Phytophthora sp.) , mais aussi avec les espèces endémiques mexicaines P. mirabilis, P. Ipomoeae et Phytophthora phaseoli - P. infestans génétiquement proches appartenant au même clade (Kroon et al., 2012). À la suite de ces analyses, il a été démontré sans ambiguïté que la partie racine de l'arbre phylogénétique de toutes les espèces du genre Phytophthora prises en compte dans l'étude, à l'exception de l'hybride P. andina, appartient à des souches mexicaines, et que le flux de migration a la direction Mexique - Andes, et non l'inverse, et son début coïncide avec celui de l'Europe. colonisation du Nouveau Monde (il y a 300 à 600 ans). Ainsi, l'émergence de l'espèce P. infestans, spécialisée dans la défaite de la pomme de terre, s'est produite dans le centre génétique secondaire de la formation des morelles tubéreuses, c'est-à-dire en Amérique centrale.
Génome de P. INFESTANS
En 2009, une équipe internationale de scientifiques a séquencé le génome complet de P infestans (Haas et al, 2009), dont la taille était de 240 Mo. C'est plusieurs fois plus que chez les espèces étroitement apparentées P. sojae (95 Mb), provoquant la pourriture des racines du soja, et P. Ramorum (65 Mb), affectant des espèces d'arbres aussi précieuses que le chêne, le hêtre et quelques autres. Les données obtenues ont montré que le génome contient un grand nombre de copies de séquences répétées - 74%. Le génome contient 17797 gènes codant pour des protéines, dont la plupart sont des gènes impliqués dans les processus cellulaires, y compris la réplication de l'ADN, la transcription et la traduction des protéines.
Une comparaison des génomes du genre Phytophthora a révélé une organisation inhabituelle du génome, consistant en des blocs de séquences de gènes conservés, dans lesquels la densité de gènes est relativement élevée et le contenu de séquences répétées est relativement faible, et des régions individuelles avec des séquences de gènes non conservées, avec une faible densité de gènes et une teneur élevée en régions répétitives. Les blocs conservateurs représentent 70% (12440) de tous les gènes codant pour la protéine P. infestans. Dans les blocs conservateurs, les gènes sont généralement étroitement espacés avec une distance intergénique moyenne de 604 pb. Dans les zones entre les blocs conservateurs, la distance intergénique est plus grande (3700 pb) en raison d'une augmentation de la densité des éléments répétitifs. Les gènes sécréteurs effecteurs à évolution rapide sont situés dans des régions pauvres en gènes.
L'analyse de séquence du génome de P. Infestans a montré qu'environ un tiers du génome appartient à des éléments transposables. Le génome de P. infestans contient beaucoup plus de familles de transposons différentes que les autres génomes connus. La plupart des transposons de P. infestans appartiennent à la famille tsigane.
Dans le génome de P. infestans, un grand nombre de familles de gènes spécifiques impliquées dans la pathogenèse ont été identifiées. Une partie importante d'entre eux codent pour des protéines effectrices qui modifient la physiologie de la plante hôte et contribuent à son infection. Ils appartiennent à deux grandes catégories: les effecteurs apoplastiques, qui agissent dans les espaces intercellulaires (apoplastes), et les effecteurs cytoplasmiques, qui pénètrent dans les cellules par haustoria. Les effecteurs apoplastiques comprennent des enzymes hydrolytiques sécrétées telles que des protéases, des lipases et des glycosylases qui détruisent les cellules végétales; les inhibiteurs des enzymes de défense de la plante hôte et les toxines nécrosantes telles que les protéines de type Nep1 (NPL) et les petites protéines riches en cystéine de type Pcf (SCR).
Les gènes effecteurs de P. infestans sont nombreux et généralement plus gros que les gènes non pathogènes. Les plus connus sont les effecteurs cytoplasmiques RXLR et Crinkler (CNR). Les effecteurs cytoplasmiques typiques des oomycètes sont les protéines RXLR. Tous les gènes effecteurs RXLR découverts jusqu'à présent contiennent le groupe amino-terminal Arg-XLeu-Arg, où X est un acide aminé. À la suite de l'étude, il a été suggéré qu'il existe 563 gènes RXLR dans le génome de P. infestans, soit 60% de plus que chez P. sojae et P. ramorum. Environ la moitié des gènes RXLR dans le génome de P. infestans sont spécifiques à l'espèce. Les effecteurs RXLR ont une grande variété de séquences. Parmi elles, une grande et 150 petites familles ont été identifiées. Contrairement au protéome principal, les gènes effecteurs RXLR sont généralement situés dans des régions du génome pauvres en gènes et riches en répétitions. Les éléments mobiles qui déterminent le dynamisme de ces régions facilitent la recombinaison dans ces gènes.
Les effecteurs CRN cytoplasmiques ont été initialement identifiés dans les transcriptions de P. infestans codant pour les peptides de nécrose des tissus végétaux. Depuis leur découverte, on en sait peu sur la famille de ces effecteurs. L'analyse du génome de P. Infestans a révélé une énorme famille de 196 gènes CRN, ce qui est significativement plus grand que chez P. sojae (100 CRN) et P. ramorum (19 CRN). Comme les RXLR, les CRN sont des protéines modulaires et consistent en un domaine LFLAK N-terminal hautement conservé (50 acides aminés) et un domaine DWL adjacent contenant différents gènes. La plupart des CRN (60%) possèdent un peptide signal.
La possibilité pour divers CRN de perturber les processus cellulaires de la plante hôte a été étudiée. Dans l'analyse de la nécrose végétale, l'élimination des protéines CRN2 a permis d'identifier la région C-terminale constituée de 234 acides aminés (positions 173-407, domaine DXG) et provoquant la mort cellulaire. L'analyse des gènes CRN de P. infestans a révélé quatre régions C-terminales différentes, qui provoquent également la mort cellulaire dans la plante. Ceux-ci incluent les domaines DC nouvellement identifiés (P. Infestans a 18 gènes et 49 pseudogènes), ainsi que les domaines D2 (14 et 43) et DBF (2 et 1) qui sont similaires aux protéines kinases. Les protéines des domaines CRN exprimés dans une plante sont conservées (en l'absence de peptides signaux) dans une cellule végétale et stimulent la mort cellulaire par un mécanisme intracellulaire. 255 autres séquences contenant des domaines CRN ne fonctionnent probablement pas comme des gènes.
L'augmentation du nombre et de la taille des familles de gènes effecteurs RXLR et CRN était vraisemblablement due à une recombinaison homologue non allélique et à une duplication de gène. Malgré le fait que le génome contient un grand nombre d'éléments mobiles actifs, il n'y a toujours pas de preuve directe du transfert de gènes effecteurs.
Méthodes utilisées dans l'étude de la structure de la population
L'étude de la structure génétique des populations repose actuellement sur l'analyse de cultures pures de ses souches constitutives. L'analyse des populations sans isoler les cultures pures est également réalisée à des fins spécifiques, comme par exemple étudier l'agressivité d'une population ou la présence de souches résistantes aux fongicides en son sein (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Ce type de recherche implique l'utilisation de méthodes spéciales dont la description sort du cadre de cette revue. Pour l'analyse comparative des souches, un certain nombre de méthodes sont utilisées, basées à la fois sur l'analyse de la structure de l'ADN et sur l'étude des manifestations phénotypiques. L'analyse comparative des populations doit traiter un grand nombre d'isolats, ce qui impose certaines exigences sur les méthodes utilisées. Idéalement, ils devraient répondre aux exigences suivantes (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- être bon marché, facile à mettre en œuvre, ne nécessitant pas de dépenses de temps importantes, être basé sur des technologies généralement disponibles (par exemple, PCR);
- doit générer un nombre suffisamment grand de marqueurs codominants indépendants;
- ont une reproductibilité élevée;
- utiliser la quantité minimale de tissu à examiner;
- être spécifique au substrat (la contamination présente dans la culture ne doit pas affecter les résultats);
- ne nécessitent pas l'utilisation de procédures dangereuses et de produits chimiques hautement toxiques.
Malheureusement, il n'existe aucune méthode correspondant à tous les paramètres ci-dessus. Pour une étude comparative des souches de notre époque, des méthodes sont utilisées basées sur l'analyse des traits phénotypiques: virulence aux variétés de pomme de terre et de tomate (races de pomme de terre et de tomate), type d'accouplement, spectres des isoenzymes peptidase et glucose-6-phosphate isomérase, et sur l'analyse de la structure de l'ADN: polymorphisme de longueur fragment de restriction (RFLP), qui est généralement complété par une sonde d'hybridation RG 57, analyse des répétitions microsatellites (SSR et InterSSR), amplification avec des amorces aléatoires (RAPD), amplification de fragments de restriction (AFLP), amplification avec des amorces homologues aux séquences d'éléments mobiles (par exemple, Inter SINE PCR), détermination des haplotypes d'ADN mitochondrial.
Brève description des méthodes d'étude comparative des souches utilisées dans le travail avec P. Infestans
Traits marqueurs phénotypiques
Courses de "pommes de terre"
Les races «pomme de terre» sont un marqueur couramment recherché et utilisé. Les races «simples de pomme de terre» ont un gène de virulence de la pomme de terre, les «complexes» - au moins deux. Black et al. (1953), résumant toutes les données dont ils disposaient, ont découvert que la race phytophthora est capable d'infecter les plantes avec le gène / les gènes de résistance correspondant au gène / aux gènes de virulence de P. infestans, et ont trouvé les races 1, 2, 3 et 4 qui infectent les plantes. avec les gènes R1, R2, R3 et R4, respectivement, i.e. l'interaction entre le parasite et l'hôte se produit gène par gène. De plus, Black, avec la participation de Gallegly et Malcolmson, a découvert les gènes de résistance R5, R6, R7, R8, R9, R10 et R11, ainsi que les races correspondantes (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Il existe un vaste corpus de données sur la composition raciale du pathogène dans différentes régions. Sans analyser ces données en détail, nous n'indiquerons qu'une tendance générale: là où des variétés avec de nouveaux gènes de résistance ou leurs combinaisons ont été utilisées, il y a eu d'abord un certain affaiblissement du mildiou, mais ensuite des races avec les gènes de virulence correspondants sont apparues et ont été sélectionnées et les foyers de mildiou ont repris. Une virulence spécifique contre les 4 premiers gènes de résistance (R1-R4) a été rarement observée dans les collections collectées avant l'introduction en culture de variétés avec ces gènes, mais le nombre de souches virulentes a fortement augmenté lorsque le pathogène parasitait des variétés porteuses de ces gènes. Les gènes 5-11, par contre, étaient assez communs dans les collections (Shaw, 1991).
Une étude du rapport des différentes races pendant la saison de croissance, réalisée à la fin des années 1980, a montré qu'au début du développement de la maladie, les clones à faible agressivité et 1 à 2 gènes de virulence prédominent dans la population.
En outre, avec le développement du mildiou, la concentration des clones d'origine diminue et le nombre de races «complexes» à forte agressivité augmente. L'occurrence de ce dernier à la fin de la saison atteint 100%. Lors du stockage des tubercules, il y a une diminution de l'agressivité et une perte de gènes de virulence individuels. La dynamique du remplacement des clones peut se produire dans différentes variétés de différentes manières (Rybakova et Dyakov, 1990). Cependant, nos études en 2000-2010 ont montré que des races complexes se retrouvent dès le début des épiphytotiques parmi les souches isolées à la fois de pommes de terre et de tomates. Cela est probablement dû à des changements dans les populations de P. Infestans en Russie.
En 1988-1995, la fréquence d'apparition de "superraces" avec tous ou presque tous les gènes de virulence dans différentes régions atteignait 70 à 100%. Une telle situation a été constatée, par exemple, en Biélorussie, dans les régions de Leningrad, de Moscou, en Ossétie du Nord et en Allemagne (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Courses de "tomates"
Dans les cultivars de tomates, seuls 2 gènes de résistance au mildiou ont été trouvés - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) et Ph2 (Al-Kherb, 1988). Comme dans le cas des races de pommes de terre, l'interaction entre les tomates et P. infestans se produit gène par gène. La race T0 infecte les variétés qui n'ont pas de gènes de résistance (la plupart des variétés utilisées industriellement), la race T1 infecte les variétés avec le gène Ph1 (Ottawa) et la race T2 infecte les variétés avec le gène Ph2.
En Russie, presque exclusivement T0 a été trouvé sur les pommes de terre; T0 prédominait sur les tomates au début de la saison, mais a été remplacé par la suite par la race T1 (Dyakov et al., 1975, 1994). Après 2000, T1 sur les pommes de terre dans de nombreuses populations a commencé à apparaître au tout début de la période épiphytotique. Aux États-Unis, les souches de pomme de terre n'étaient pas pathogènes pour la tomate, ainsi que pour les races T0, T1 et T2, tandis que T1 et T2 prédominaient sur les tomates (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Type d'accouplement
Pour mener l'étude, des souches testeurs (de référence) avec des types d'accouplement connus - A1 et A2 sont nécessaires. L'isolat de test est inoculé avec eux par paires dans des boîtes de Pétri avec du milieu gélose à l'avoine. Après 10 jours d'incubation, les plaques sont examinées pour la présence ou l'absence d'oospores dans le milieu dans la zone de contact des souches. Il y a 4 options: la souche appartient au type d'accouplement A1, si elle forme des oospores avec le testeur A2, à A2, si elle forme des oospores avec le testeur A1, à A1A2, si elle forme des oospores avec les deux testeurs, ou est stérile (00), si elle ne forme pas d'oospores sans testeur (les deux derniers groupes sont rares).
Pour déterminer plus rapidement les types d'accouplement, des tentatives ont été faites pour identifier les régions du génome associées au type d'accouplement, dans le but de leur utilisation ultérieure pour déterminer le type d'accouplement par PCR. L'une des premières expériences réussies pour identifier un tel site a été menée par des chercheurs américains (Judelson et al., 1995). En utilisant la méthode RAPD, ils ont pu identifier la région W16 associée au type d'accouplement chez la progéniture de deux isolats croisés, et concevoir une paire d'amorces de 24 pb pour son amplification (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') et W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Après restriction du produit de PCR avec l'enzyme de restriction HaeIII, il a été possible de séparer les isolats avec les types d'appariement A1 et A2.
Une autre tentative pour obtenir des marqueurs PCR pour déterminer les types d'accouplement a été entreprise par des chercheurs coréens (Kim, Lee, 2002). Ils ont identifié des produits spécifiques en utilisant la méthode AFLP. En conséquence, une paire d'amorces PHYB-1 (avant) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') et PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') ont été développées, permettant une amplification sélective de la région génomique associée au type d'accouplement A2. Par la suite, ils ont poursuivi ce travail et conçu des amorces 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, avant) et 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), permettant une amplification sélective de la région Mat-A1 caractéristique des souches de type d'accouplement A1. L'utilisation du diagnostic par PCR des types d'accouplement a donné de bons résultats lors de l'étude des populations de P. infestans en République tchèque (Mazakova et al., 2006), en Tunisie (Jmour, Hamada, 2006) et dans d'autres régions. Dans notre laboratoire (Mytsa, Elansky, non publié), 34 souches de P. infestans isolées des organes affectés de pommes de terre et de tomates dans différentes régions de Russie (régions de Kostroma, Ryazan, Astrakhan et Moscou) ont été analysées. Les résultats de l'analyse PCR utilisant des amorces spécifiques à plus de 90% ont coïncidé avec les résultats de l'analyse du type d'accouplement par la méthode traditionnelle sur un milieu nutritif.
Tableau 1. Variabilité de la résistance au sein du clone Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Lieu de prélèvement des échantillons | Nombre d'isolats analysés | Nombre de souches sensibles (S), faiblement résistantes (SR) et résistantes (R), pcs (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkoutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnoyarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Ville d'Ekaterinbourg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sakhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Région d'Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Résistance au métalaxyl comme marqueur de population
Au début des années 1980, de puissantes flambées de mildiou causées par des souches de P. infestans résistantes au métalaxyl ont été notées dans diverses régions. Les exploitations de pommes de terre de nombreux pays ont subi des pertes importantes (Dowley et O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Depuis lors, dans de nombreux pays du monde, une surveillance constante de l'apparition de souches résistantes au phénylamide dans les populations de P. infestans a été menée. Outre une évaluation pratique des perspectives d'utilisation des médicaments contenant du phénylamide, la construction d'un système de mesures de protection et la prévision des épiphytoties, la résistance à ces médicaments est devenue l'un des marqueurs largement utilisés pour l'analyse comparative des populations de ce pathogène. Cependant, l'utilisation de la résistance au métalaxyl dans les études comparatives de population doit être réalisée en tenant compte du fait que: 1 - la base génétique de la résistance n'a pas encore été déterminée avec précision, 2 - la résistance au métalaxyl est un caractère sélectivement dépendant qui peut varier en fonction de l'utilisation de phénylamides, 3 - différent le degré de sensibilité aux souches de métalaxyl dans une ligne clonale (tableau. 1).
Spectres d'isozymes
Les marqueurs isozymes sont généralement indépendants des conditions externes, montrent un héritage mendélien et sont codominants, permettant de distinguer les homo- et les hétérozygotes. L'utilisation de protéines comme marqueurs géniques permet d'identifier à la fois de grandes réorganisations du matériel génétique, y compris des mutations chromosomiques et génomiques, et des substitutions d'acides aminés uniques.
Les études électrophorétiques des protéines ont montré que la plupart des enzymes existent dans les organismes sous la forme de plusieurs fractions différant par la mobilité électrophorétique. Ces fractions sont le résultat du codage de plusieurs formes d'enzymes par différents locus (isozymes ou isozymes) ou par différents allèles du même locus (allozymes ou alloenzymes). Autrement dit, les isozymes sont différentes formes d'une enzyme. Différentes formes ont la même activité catalytique, mais diffèrent légèrement dans les substitutions d'acides aminés simples dans le peptide et en charge. Ces différences sont révélées lors de l'électrophorèse.
Lors de l'étude des souches de P. infestans, les spectres d'isoenzymes de deux protéines, la peptidase et la glucose-6-phosphate isomérase, sont utilisés (cette enzyme est monomorphe dans les populations russes; par conséquent, les méthodes de son étude ne sont pas présentées dans ce travail). Pour les séparer en isozymes dans un champ électrique, des préparations protéiques isolées des organismes étudiés sont appliquées sur une plaque de gel placée dans un champ électrique. La vitesse de diffusion des protéines individuelles dans le gel dépend de la charge et du poids moléculaire; par conséquent, dans un champ électrique, le mélange de protéines est séparé en fractions individuelles, qui peuvent être visualisées à l'aide de colorants spéciaux.
L'étude des isoenzymes peptidases est réalisée sur des gels d'acétate de cellulose, d'amidon ou de polyacrylamide. Le plus pratique est la méthode basée sur l'utilisation de gels d'acétate de cellulose fabriqués par Helena Laboratories Inc. Il ne nécessite pas de grandes quantités de matériaux de test, il permet d'obtenir des bandes contrastées sur le gel après électrophorèse pour les deux locus enzymatiques, sa mise en œuvre ne nécessite pas de temps et de coûts matériels importants (Fig. 2).
Un petit morceau de mycélium est transféré dans un microtube de 1,5 ml, 1 à 2 gouttes d'eau distillée y sont ajoutées. Après cela, l'échantillon est homogénéisé (par exemple, avec une perceuse électrique avec un accessoire en plastique adapté pour un microtube) et sédimenté pendant 25 secondes sur une centrifugeuse à 13000 tr / min. 8 μl de chaque microtube. le surnageant est transféré sur la plaque applicatrice.
Le gel d'acétate de cellulose est retiré du récipient de tampon, tamponné entre deux feuilles de papier filtre et placé avec la couche de travail sur la base en plastique de l'applicateur. La solution de la plaque est transférée par l'applicateur sur le gel 2 à 4 fois. Le gel est transféré dans une chambre d'électrophorèse,
Tableau 2. La composition de la solution utilisée pour colorer le gel d'acétate de cellulose dans l'analyse des isoenzymes peptidases, une goutte de peinture (bleu de bromophénol) est déposée sur le bord du gel.
TRIS HCl, 0,05 M, pH 8,0 2 ml
Peroxydase, 1000 U / ml 5 gouttes
o-dianisidine, 4 mg / ml 8 gouttes
MgCl2, 20 mg / ml 2 gouttes
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 gouttes
L-amino-acide oxydase, 20 u / ml 2 gouttes
L'électrophorèse est réalisée pendant 20 minutes. à 200 V. Après électrophorèse, le gel est transféré sur une table de peinture et coloré avec une solution de peinture spéciale (tableau 2). 10 ml d'agar DIFCO 1,6% sont préalablement fondus dans un four à micro-ondes, refroidis à 60 ° C, après quoi 2 ml d'agar sont mélangés avec un mélange de peinture et versés sur un gel. Les rayures apparaissent dans les 15 à 20 minutes. Le réactif L-amino-acide oxydase est ajouté immédiatement avant de mélanger la solution avec de la gélose fondue.
Dans les populations russes, le locus Pep 1 est représenté par les génotypes 100/100 et 92/100. L'homozygote 92/92 est extrêmement rare (environ 0,1%). Le locus Rehr 2 est représenté par trois génotypes 100/100, 100/112 et 112/112, et les 3 variantes sont assez communes (Elanky et Smirnov, 2003, figure 2).
Recherche génomique
Polymorphisme de longueur de fragment de restriction avec hybridation ultérieure (RFLP-RG 57)
L'ADN total est traité avec l'enzyme de restriction Eco R1, les fragments d'ADN sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose. L'ADN nucléaire est très volumineux et possède de nombreuses séquences répétitives, il est donc difficile d'analyser directement les nombreux fragments obtenus par l'action d'enzymes de restriction. Par conséquent, les fragments d'ADN séparés dans le gel sont transférés sur une membrane spéciale et utilisés pour l'hybridation avec la sonde RG 57, qui comprend des nucléotides marqués avec des marqueurs radioactifs ou fluorescents. Cette sonde s'hybride avec des séquences génomiques répétitives (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Après visualisation des résultats d'hybridation sur un matériau léger ou radioactif, on obtient un profil d'hybridation multi-locus (fingerprinting), représenté par 25-29 fragments (Forbes et al., 1998). La progéniture asexuée (clonale) aura les mêmes profils. La disposition des bandes sur l'électrophorétogramme est utilisée pour juger des similitudes et des différences des organismes comparés.
Haplotypes d'ADN mitochondrial
Dans la plupart des cellules eucaryotes, l'ADNmt se présente sous la forme d'une molécule d'ADN circulaire double brin, qui, contrairement aux chromosomes nucléaires des cellules eucaryotes, se réplique de manière semi-conservatrice et n'est pas associée à des molécules protéiques.
Le génome mitochondrial de P. infestans a été séquencé et un certain nombre de travaux ont été consacrés à l'analyse de la longueur des fragments de restriction (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Après que Griffith et Shaw (1998) ont développé une méthode simple et rapide pour déterminer les haplotypes d'ADNmt, ce marqueur est devenu l'un des plus populaires dans les études de P. Infestans.L'essence de la méthode consiste en l'amplification séquentielle de deux fragments d'ADN mitochondrial (du génome commun) avec les amorces F2-R2 et F4-R4 (tableau 3) et leur restriction ultérieure avec les enzymes de restriction MspI (1er fragment) et EcoR1 (2ème fragment). La méthode permet d'identifier 4 haplotypes: Ia, IIa, Ib, IIb. Le type II diffère du type I par la présence d'un insert de taille de 1881 pb et par un emplacement différent des sites de restriction dans les régions P2 et P4 (figure 3).
Depuis 1996, parmi les souches collectées sur le territoire de la Russie, seuls les haplotypes Ia et IIa ont été relevés (Elansky et al., 2001, 2015). Ils peuvent être identifiés après séparation des produits de restriction avec l'amorce F2-R2 dans un champ électrique (Fig. 4, 5). Les types d'ADNmt sont utilisés dans l'analyse comparative des souches et des populations. Dans un certain nombre d'études, des types d'ADN mitochondrial ont été utilisés pour isoler des lignées clonales et passer des isolats de P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). En utilisant la méthode PCR-RFLP, il a été conclu que l'ADNmt est hétérogène dans la même souche de P. infestans (Elansky et Milyutina, 2007). Conditions d'amplification: 1x (500 sec. 94 ° C), 40x (30 sec. 90 ° C, 30 sec. 52 ° C, 90 sec. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Mélange réactionnel: (20 μl): 0,2 U d'ADN polymérase Taq, 1x tampon MgCl2,5-Taq 2 mM, 0,2 mM chaque dNTP, 30 pM d'amorce et 5 ng de l'ADN analysé, eau désionisée - jusqu'à 20 μl.
La restriction du produit PCR est effectuée pendant 4-6 heures à une température de 37 ° C. Mélange de restriction (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x tampon de restriction (2 μl), eau désionisée (6 μl), produit de PCR (10 μl).
Tableau 3. Amorces utilisées pour l'amplification des régions polymorphes de l'ADNmt
Lieu | Primer | Longueur et placement de l'apprêt | Longueur du produit PCR | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21 ; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22 ; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22 ; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4 : 5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22 ; 10292-10271 |
Amplification aléatoire des amorces (RAPD)
Lors de la réalisation de RAPD, une amorce est utilisée (parfois plusieurs amorces simultanément) avec une séquence nucléotidique arbitraire, généralement de 10 nucléotides de longueur, avec une teneur élevée (à partir de 50%) de nucléotides GC et une faible température d'hybridation (environ 35 ° C). Ces amorces «atterrissent» sur de nombreux sites complémentaires du génome. Après amplification, un grand nombre d'amplicons sont obtenus. Leur nombre dépend de la ou des amorces utilisées et des conditions de réaction (concentration en MgCl2 et température d'hybridation).
La visualisation des amplicons est réalisée par distillation en polyacrylamide ou gel d'agarose. Lors de l'analyse RAPD, il est nécessaire de surveiller attentivement la pureté du matériau analysé, car la contamination par d'autres objets vivants peut entraîner une augmentation significative du nombre d'artefacts, qui sont assez nombreux dans l'analyse du matériel pur (Perez et al, 1998). L'utilisation de cette méthode dans l'étude du génome de P. infestans se reflète dans de nombreux travaux (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). La sélection des conditions de réaction et des amorces (51 amorces de 10 nucléotides ont été étudiées) est donnée dans l'article d'Abu-El Samen et al., (2003).
Analyse répétée des microsatellites (SSR)
Les répétitions microsatellites (répétitions de séquences simples, SSR) sont des séquences courtes répétées en tandem de 1-3 (parfois jusqu'à 6) nucléotides présents dans les génomes nucléaires de tous les eucaryotes. Le nombre de répétitions successives peut varier de 10 à 100. Les locus microsatellites se produisent avec une fréquence assez élevée et sont plus ou moins uniformément répartis dans tout le génome (Lagercrantz et al., 1993). Le polymorphisme des séquences microsatellites est associé à des différences dans le nombre de répétitions du motif de base. Les marqueurs microsatellites sont codominants, ce qui permet de les utiliser pour analyser la structure de la population, déterminer la parenté, les voies de migration des génotypes, etc. Parmi les autres avantages de ces marqueurs, il convient de noter leur polymorphisme élevé, leur bonne reproductibilité, leur neutralité et leur capacité à effectuer des analyses et des évaluations automatiques.L'analyse du polymorphisme des répétitions microsatellites est réalisée par amplification par PCR à l'aide d'amorces complémentaires aux séquences uniques flanquant les loci microsatellites. Dans un premier temps, l'analyse a été réalisée avec la séparation des produits de réaction sur un gel de polyacrylamide. Plus tard, les employés d'Applied Biosystems ont proposé d'utiliser des amorces marquées par fluorescence avec détection des produits de réaction à l'aide d'un détecteur laser automatique (Diehl et al., 1990), puis des séquenceurs automatiques standard d'ADN (Ziegle et al., 1992). Le marquage des amorces avec divers colorants fluorescents permet d'analyser plusieurs marqueurs à la fois sur une voie et, par conséquent, d'augmenter considérablement la productivité de la méthode et d'augmenter la précision de l'analyse.
Les premières publications consacrées à l'utilisation de l'analyse SSR pour l'étude de P. infestans sont apparues au début des années 2000. (Knapova, Gisi, 2002). Tous les marqueurs proposés par les auteurs n'ont pas montré un degré de polymorphisme suffisant, cependant, deux d'entre eux (4B et G11) ont été inclus dans l'ensemble des 12 marqueurs SSR proposés par Lees et al. (2006) et adoptés par la suite dans le réseau de recherche Eucablight (www.eucablight .org) comme norme pour P. infestans. Quelques années plus tard, une étude a été publiée sur la création d'un système d'analyse multiplexe de l'ADN de P. infestans basé sur huit marqueurs SSR (Li et al., 2010). Enfin, après avoir évalué tous les marqueurs précédemment proposés et sélectionné le plus informatif d'entre eux, ainsi que l'optimisation des amorces, des marqueurs fluorescents et des conditions d'amplification, le même groupe d'auteurs a présenté un système d'analyse multiplex en une étape, comprenant 12 marqueurs (Tableau 4; Li et al. , 2013a). Les amorces utilisées dans ce système ont été sélectionnées et marquées avec l'un des quatre marqueurs fluorescents (FAM, VIC, NED, PET) de sorte que les plages des tailles d'allèles des amorces avec les mêmes marqueurs ne se chevauchent pas.
Les auteurs ont réalisé l'analyse sur un amplificateur PTC200 (MJ Research, USA) en utilisant des kits de PCR multiplex QIAGEN ou des kits de PCR QIAGEN Typeit Microsatellite. Le volume du mélange réactionnel était de 12.5 µL. Les conditions d'amplification étaient les suivantes: pour la PCR multiplex QIAGEN: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); pour QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (20 s), 60 ° C (30 min).
La séparation et la visualisation des produits de PCR ont été réalisées à l'aide d'un analyseur automatique d'ADN capillaire ABI3730 (Applied Biosystems).
Tableau 4. Caractéristiques de 12 marqueurs SSR standard utilisés pour le génotypage de P. Infestans (Li et al., 2013a)
Nom | Nombre d'allèles | Gamme de taille allèles (pb) | Amorces |
PiG11 | 13 | 130-180 | F : NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R : GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F : NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R : GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F : NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R : GTTTAGACAATTGTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F : FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R : GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F : FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R : GTTTACAAGATACACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F : FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R : GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F : VIC-AGCGGCTTACCGATGG R : GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F : VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R : CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F : VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R : CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F : PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R : GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F : PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R : GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Un exemple de visualisation des résultats d'analyse est illustré à la Fig. 6. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel GeneMapper 3.7 en comparant les données obtenues avec celles d'isolats connus. Pour faciliter l'interprétation des résultats de l'analyse, il est nécessaire d'inclure 1 à 2 isolats de référence avec un génotype connu dans chaque étude.
La méthode de recherche proposée a été testée sur un nombre important d'échantillons sur le terrain, après quoi les auteurs ont procédé à la standardisation des protocoles entre les laboratoires de deux organisations, le James Hutton Institute (Royaume-Uni) et Wageningen University & Research (Pays-Bas), qui, avec la possibilité d'utiliser des cartes FTA standard pour simplifier la collecte et l'envoi d'échantillons d'ADN de P. infestans ont permis d'évoquer la possibilité d'une utilisation commerciale de ce développement. De plus, une méthode rapide et précise de génotypage des isolats de P. infestans par analyse multiplex SSR a permis de mener des études standardisées de populations de ce pathogène à l'échelle mondiale, et la création d'une base de données mondiale sur le mildiou dans le cadre du projet Eucablight (www.eucablight.org), y compris , y compris les résultats de l'analyse des microsatellites, ont permis de suivre l'émergence et la propagation de nouveaux génotypes dans le monde.
Polymorphisme amplifié de la longueur des fragments de restriction (AFLP). AFLP (amplified fragment length polymorphism) est une technologie permettant de générer des marqueurs moléculaires aléatoires à l'aide d'amorces spécifiques. Dans l'AFLP, l'ADN est traité avec une combinaison de deux enzymes de restriction. Des adaptateurs spécifiques sont ligaturés aux extrémités collantes des fragments de restriction.
Ces fragments sont ensuite amplifiés à l'aide d'amorces complémentaires de la séquence adaptatrice et du site de restriction et portant en outre une ou plusieurs bases aléatoires à leurs extrémités 3 '. L'ensemble de fragments obtenu dépend des enzymes de restriction et des nucléotides choisis au hasard aux extrémités 3 'des amorces (Vos et al., 1995). AFLP - le génotypage est utilisé pour étudier rapidement la variation génétique de divers organismes.
Une description détaillée de la méthode est donnée dans les travaux de Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. De nombreux travaux comparant la résolution des méthodes AFLP et SSR ont été réalisés par des chercheurs chinois. Les caractéristiques phénotypiques et génotypiques de 48 isolats de P. infestans collectés dans cinq régions du nord de la Chine ont été étudiées. Sur la base des spectres AFLP, huit génotypes d'ADN différents ont été identifiés, contrairement aux génotypes SSR, pour lesquels aucune diversité n'a été révélée (Guo et al., 2008).
Amplification avec des amorces homologues aux séquences d'éléments mobiles
Les marqueurs dérivés de séquences de rétrotransposons sont très pratiques pour la cartographie génétique, l'étude de la diversité génétique et les processus évolutifs (Schulman, 2006). Si des amorces sont faites pour compléter les séquences stables de certains éléments mobiles, il est possible d'amplifier les régions génomiques situées entre eux. Dans les études sur l'agent causal du mildiou, la méthode d'amplification des régions du génome à l'aide d'une amorce complémentaire à la séquence centrale de la rétroazone SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) a été utilisée avec succès (Lavrova et Elansky, 2003). En utilisant cette méthode, des différences ont été révélées même chez les descendants asexués d'un isolat. À cet égard, il a été conclu que la méthode inter - SINE - PCR est très spécifique et que le taux de mouvement des éléments SINE dans le génome de Phytophthora est élevé.
Dans le génome de P. infestans, 12 familles de rétrotransposons courts (SINE) ont été identifiées; la distribution des espèces de rétrotransposons courts a été étudiée; les éléments (SINE) qui se trouvent dans le génome de P. infestans seulement ont été identifiés (Lavrova, 2004).
Caractéristiques de l'application des méthodes d'étude comparative des souches dans les études de population
Lors de la planification d'une étude, il faut bien comprendre les objectifs qu'elle poursuit et utiliser les méthodes appropriées. Ainsi, certaines méthodes permettent de générer un grand nombre de signes marqueurs indépendants, mais en même temps ont une faible reproductibilité et dépendent fortement des réactifs utilisés, des conditions de réaction et de la contamination du matériel d'essai. Par conséquent, dans chaque étude d'un groupe de souches, il est nécessaire d'utiliser plusieurs isolats standard (de référence), mais même dans ce cas, les résultats de plusieurs expériences sont très difficiles à combiner.
Ce groupe de méthodes comprend RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Après amplification, un grand nombre de fragments d'ADN de tailles différentes sont obtenus. Il est conseillé d'utiliser de telles techniques s'il est nécessaire d'établir des différences entre des souches étroitement apparentées (parent-descendance, mutants de type sauvage, etc.), ou dans les cas où une analyse détaillée d'un petit échantillon est nécessaire. Ainsi, la méthode AFLP est largement utilisée dans la cartographie génétique de P. infestans (van der Lee et al., 1997) et dans les études d'intrapopulation (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Ces méthodes sont inappropriées à utiliser lors de la création de bases de données de souches, car il est pratiquement impossible d'unifier la comptabilité des résultats lors de la réalisation d'analyses dans différents laboratoires.
Malgré la simplicité apparente et la rapidité d'exécution (isolement d'ADN sans bonne purification, amplification, visualisation des résultats), ce groupe de méthodes nécessite l'utilisation d'une méthode spéciale pour documenter les résultats: distillation en gel de polyacrylamide avec des amorces marquées (radioactives ou luminescentes) et illumination ultérieure de lumière ou de matière radioactive. L'imagerie conventionnelle sur gel d'agarose au bromure d'éthidium n'est généralement pas adaptée à ces méthodes car un grand nombre de fragments d'ADN de différentes tailles peuvent fusionner.
D'autres méthodes, au contraire, permettent de générer un petit nombre de caractéristiques avec leur très haute reproductibilité. Ce groupe comprend l'étude des haplotypes d'ADN mitochondrial (seuls deux haplotypes Ia et IIa sont notés en Russie), le type d'accouplement (la plupart des isolats sont subdivisés en 2 types: A1 et A2, SF autofertile est rarement trouvé) et les spectres d'isozymes peptidase (deux loci Pep1 et Pep2 , composé de deux isozymes chacun) et de la glucose-6-phosphate isomérase (en Russie, il n'y a pas de variabilité pour ce caractère, bien qu'un polymorphisme significatif soit noté dans d'autres pays du monde). Il est conseillé d'utiliser ces fonctionnalités lors de l'analyse des collections, de la compilation de bases de données régionales et mondiales. Dans le cas de l'analyse des isozymes et des haplotypes d'ADN mitochondrial, il est possible de se passer des souches standard, alors que dans l'analyse des types d'accouplement, deux isolats d'essai avec des types d'accouplement connus sont nécessaires.
Les conditions de réaction et les réactifs ne peuvent affecter que le contraste du produit sur l'électrophorétogramme; la manifestation d'artefacts dans ces types d'études est peu probable.
Actuellement, la majorité des populations de la partie européenne de la Russie sont représentées par des souches des deux types d'accouplement (tableau 6), parmi lesquelles il y a des isolats avec les types Ia et IIa d'ADN mitochondrial (d'autres types d'ADNmt trouvés dans le monde n'ont pas été trouvés en Russie après 1993). Les spectres des isozymes de la peptidase sont représentés par deux génotypes au locus Pep1 (100/100, 92/92 et hétérozygote 92/100, et le génotype 92/92 est extrêmement rare (<0,3%)) et deux génotypes au locus Pep 2 (100/100 , 112/112 et hétérozygote 100/112, le génotype 112/112 se produisant moins fréquemment que 100/100, mais aussi assez souvent).
Il n'y avait pas de variabilité dans le spectre des isozymes de la glucose-6-phosphate isomérase après 1993 (disparition de la lignée clonale US-1); tous les isolats étudiés avaient le génotype 100/100 (Elansky et Smirnov, 2002).
Le troisième groupe de méthodes permet d'obtenir un groupe suffisant de caractéristiques de marqueurs indépendants avec une reproductibilité élevée. Aujourd'hui, ce groupe comprend la sonde RFLP-RG57, qui produit 25 à 29 fragments d'ADN de différentes tailles. RFLP-RG57 peut être utilisé à la fois lors de l'analyse d'échantillons et de la compilation de bases de données. Cependant, cette méthode est beaucoup plus coûteuse que les précédentes, elle prend du temps et nécessite une quantité suffisamment importante d'ADN hautement purifié. Par conséquent, le chercheur est contraint de limiter le volume du matériau testé.
Le développement du RFLP-RG57 au début des années 90 du siècle dernier a considérablement intensifié les études démographiques de l'agent causal du mildiou. Il est devenu la base de la méthode basée sur la sélection et l'analyse des «lignées clonales» (voir ci-dessous). Avec RFLP-RG57, le type d'accouplement, l'empreinte ADN (méthode RFLP-RG57), les spectres des isoenzymes peptidase et glucose-6-phosphate isomérase et le type d'ADN mitochondrial sont utilisés pour identifier les lignées clonales. Grâce à lui, il a été montré al., 1994), le remplacement des anciennes populations par de nouvelles (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), et les lignées clonales qui prévalent dans de nombreux pays du monde ont été identifiées. Des études de souches russes utilisant cette méthode ont montré un polymorphisme génotypique élevé des souches de la partie européenne et un monomorphisme des populations des parties asiatique et extrême-orientale de la Russie (Elansky et al, 2001). Et maintenant, cette méthode reste la principale dans les études de population de P. infestans. Cependant, sa large distribution est entravée par son coût et son intensité de main-d’œuvre plutôt élevés.
L'analyse des répétitions microsatellites (SSR) est une autre technique prometteuse qui est rarement utilisée dans les études sur P. infestans. Actuellement, cette méthode est largement utilisée pour isoler des lignées clonales. Pour l'analyse des souches, des traits marqueurs phénotypiques tels que la présence de gènes de virulence sur les variétés de pommes de terre (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) et la tomate ont été largement utilisés (et continuent d'être utilisés). À l'heure actuelle, les gènes de virulence des variétés de pommes de terre ont perdu leur valeur en tant que traits marqueurs pour les études de population en raison de l'apparition du nombre maximal (ou proche de celui-ci) de gènes de virulence dans la grande majorité des isolats. Dans le même temps, le gène de virulence T1 pour les cultivars de tomates porteurs du gène Ph1 correspondant est toujours utilisé avec succès comme trait marqueur (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
Dans de nombreux travaux, la résistance aux fongicides est utilisée comme marqueur. Cette caractéristique n'est pas souhaitable à utiliser dans les études de population en raison de l'apparition plutôt facile de mutations de résistance dans les lignées clonales après l'application de fongicides contenant du métalaxyl (ou du méfénoxame) sur le terrain. Par exemple, des différences significatives dans le niveau de résistance ont été montrées au sein de la lignée clonale Sib1 (Elansky et al., 2001).
Ainsi, le type d'accouplement, le spectre des isoenzymes peptidase, le type d'ADN mitochondrial, RFLP-RG57, SSR sont les caractéristiques marquantes préférées pour créer des banques de données et marquer des souches dans des collections. Pour comparer des échantillons limités, s'il est nécessaire d'appliquer le nombre maximum de caractéristiques de marqueur, vous pouvez utiliser AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tableau 5). Cependant, il convient de rappeler que ces méthodes sont peu reproductibles et que dans chaque expérience individuelle (cycle d'électrophorèse d'amplification), il est nécessaire d'utiliser plusieurs isolats de référence.
Tableau 5. Comparaison des différentes méthodes de recherche des souches P. infestans
critère | TC | Flics Isofer | ADNmt | RFLP-RG57 | RAPD | SISR | RSS | AFLP | Tour |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Quantité d'informations | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproductibilité | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Possibilité d'artefacts | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
coût de | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intensité de travail | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Vitesse d'analyse ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Remarque: H - faible, C - moyen, B - élevé; НС * - l'intensité du travail est faible lors de l'utilisation de gel d'agarose ou automatique
génotypeur, milieu - par distillation en gel de polyacrylamide avec des amorces marquées,
** - sans compter le temps passé à cultiver du mycélium pour l'isolement de l'ADN.
Structure de la population
Lignes clonales
En l'absence de recombinaison ou de sa contribution insignifiante à la structure de la population, la population est constituée d'un certain nombre de clones, dont les échanges génétiques sont extrêmement rares.
Dans ces populations, il est plus instructif d'étudier non pas les fréquences de gènes individuels, mais les fréquences de génotypes qui ont une origine commune (lignées clonales ou lignées clonales) et ne diffèrent que par des mutations ponctuelles. Les études de population du pathogène du mildiou et l'analyse des lignées clonales se sont considérablement accélérées depuis l'avènement de la méthode RFLP-RG57 au début des années 90 du siècle dernier. Avec RFLP-RG57, le type d'accouplement, les spectres des isoenzymes peptidase et glucose-6-phosphate isomérase et le type d'ADN mitochondrial sont utilisés pour identifier les lignées clonales. Les caractéristiques des lignées clonales les plus courantes sont présentées dans le tableau 6.
Le clone US-1 a dominé les populations partout jusqu'à la fin des années 80, après quoi il a commencé à être remplacé par d'autres clones et a disparu d'Europe et d'Amérique du Nord. On le trouve maintenant en Extrême-Orient (Philippines, Taiwan, Chine, Japon, Corée, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), en Afrique (Ouganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al., 2000; Ochwo et al., 2002) et en Amérique du Sud (Equateur, Brésil, Pérou, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Aucune souche appartenant à la lignée US-1 n'a été identifiée en Australie uniquement. Apparemment, les isolats de P. infestans sont arrivés en Australie avec une autre vague de migration (Goodwin, 1997).
Le clone US-6 a migré du nord du Mexique vers la Californie à la fin des années 70 et y a provoqué une épidémie de pommes de terre et de tomates après 32 ans sans maladie. En raison de sa grande agressivité, il a remplacé le clone US-1 et a commencé à dominer sur la côte ouest des États-Unis (Goodwin et al., 1995a).
Les génotypes US-7 et US-8 ont été découverts aux États-Unis en 1992, et déjà en 1994, ils étaient largement distribués aux États-Unis et au Canada. Au cours d'une saison sur le terrain, le clone US-8 est capable de déplacer presque complètement le clone US-1 dans des parcelles de pommes de terre initialement infectées par les deux clones à une concentration égale (Miller et Johnson, 2000).
Les clones BC-1 à BC-4 ont été identifiés en Colombie-Britannique dans un petit nombre d'isolats de Goodwin et al., 1995b). Le clone US-11 s'est largement répandu aux États-Unis et a supplanté l'US-1 à Taiwan. Les clones JP-1 et EC-1, ainsi que le clone US-1, sont communs au Japon et en Equateur, respectivement (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 est un clone qui a prévalu en Russie sur un vaste territoire allant de la région de Moscou à Sakhaline. Dans la région de Moscou, il a été découvert en 1993, et certaines populations de terrain étaient principalement constituées de souches de cette lignée clonale, très résistante au métalaxyl. Après 1993, la prévalence de ce clone a considérablement diminué. En dehors de l'Oural en 1997-1998, le SIB-1 a été trouvé partout, à l'exception du territoire de Khabarovsk (le clone SIB-2 y est répandu). La séparation spatiale des clones avec différents types d'accouplement exclut le processus sexuel en Sibérie et en Extrême-Orient. Dans la région de Moscou, contrairement à la Sibérie, la population est représentée par de nombreux clones; presque tous les isolats ont un génotype multilocus unique (Elansky et al., 2001, 2015). Cette diversité ne peut s'expliquer uniquement par l'importation de souches du champignon provenant de différentes parties du monde avec des semences importées. Comme les deux types d'accouplement se produisent dans la population, il est possible que sa diversité soit également due à la recombinaison. Ainsi, en Colombie-Britannique, l'émergence des génotypes BC-2, BC-3 et BC-4 est présumée en raison de l'hybridation des clones BC-1 et US-6 (Goodwin et al., 1995b). Il est possible que des souches hybrides se trouvent dans les populations de Moscou. Par exemple, les souches MO-4, MO-8 et MO-11 hétérozygotes pour le locus PEP peuvent être des hybrides entre les souches MO-12, MO-21, MO-22, ayant le type d'accouplement A2 et homozygotes pour un allèle du locus PEP et la souche MO-8, ayant le type d'accouplement A1 et homozygote pour l'autre allèle du locus. Et si tel est le cas, et dans les populations modernes de P. infestans, il y a une tendance à une augmentation du rôle du processus sexuel, alors la valeur informationnelle de l'analyse des clones multilocus diminuera (Elansky et al., 2001, 2015).
Variation des lignes clonales
Jusque dans les années 90 du 20e siècle, la lignée clonale US-1 était répandue dans le monde. La plupart des populations sur le terrain et régionales se composaient exclusivement de souches de génotype US-1. Cependant, des différences entre les isolats ont également été observées, probablement causées par un processus de mutation. Des mutations se sont produites à la fois dans l'ADN nucléaire et mitochondrial et ont affecté, entre autres, le niveau de résistance aux médicaments phénylamides et le nombre de gènes de virulence. Les lignées qui diffèrent des génotypes d'origine par des mutations sont indiquées par des nombres supplémentaires après le point suivant le nom du génotype d'origine (par exemple, la lignée mutante US-1.1 de la lignée clonale US-1). Les lignées d'ADN d'empreintes digitales US-1.5 et US-1.6 contiennent des lignées accessoires de différentes tailles (Goodwin et al., 1995a, 1995b); la lignée clonale US-6.3 diffère également de US-6 par une lignée accessoire (Goodwin, 1997, tableau 7).
Dans l'étude de l'ADN mitochondrial, il a été trouvé que dans la lignée clonale US-1, on ne trouve que le type 1b d'ADN mitochondrial (Carter et al., 1990). Cependant, dans l'étude des souches de cette lignée clonale du Pérou et des Philippines, des isolats ont été trouvés dont les types d'ADN mitochondrial différaient de 1b par la présence d'insertions et de délétions (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tableau 6. Génotypes multi-focus de certaines lignées clonales de P. infestans
Nom | Type d'accouplement | Isozymes | Empreintes ADN | Type d'ADNmt | |
GPI | PEP | ||||
États-Unis 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
États-Unis 2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
États-Unis 3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
États-Unis 4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
États-Unis 5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
États-Unis 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
États-Unis 7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
États-Unis 8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
États-Unis 9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
États-Unis 10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
États-Unis 11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
États-Unis 12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
États-Unis 14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
États-Unis 15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
États-Unis 16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
États-Unis 17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
États-Unis 18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
États-Unis 19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
CE-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Remarque: * - pas de données.
Tableau 7. Génotypes Multilocus et leurs lignées mutantes
Nom | Type d'accouplement | | Empreintes ADN (RG57) | notes | |
GPI | PEP-1 | ||||
États-Unis 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Génotype original 1 |
États-Unis 1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutation en PEP |
États-Unis 1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation dans RG57 |
États-Unis 1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutation dans RG57 |
États-Unis 1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation dans RG57 et PEP |
États-Unis 1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutation dans RG57 |
États-Unis 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Génotype original 2 |
États-Unis 6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutation en PEP |
États-Unis 6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutation dans RG57 |
États-Unis 6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutation dans RG57 |
États-Unis 6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutation dans RG57 et PEP |
États-Unis 6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutation dans RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Génotype original 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutation dans RG57 |
Il y a également des changements dans le spectre des isozymes. En règle générale, ils sont causés par la décomposition d'un organisme initialement hétérozygote pour cette enzyme en homozygotes. En 1993, sur les fruits de la tomate, nous avons identifié une souche avec des caractéristiques typiques de l'empreinte US-1: RG57, du type d'ADN mitochondrial et du génotype 86/100 pour la glucose-6-phosphatizomérase, mais elle était homozygote (100/100) pour le premier locus de la peptidase au lieu de un hétérozygote 92/100 typique de cette lignée clonale. Nous avons nommé le génotype de cette souche MO-17 (tableau 6). Les lignées mutantes US-1.1 et US-1.4 diffèrent également de US-1 par des mutations au niveau du premier locus peptidase (tableau 7).
Les mutations entraînant des modifications du nombre de gènes de virulence pour les variétés de pommes de terre et de tomates sont assez fréquentes. Ils ont été notés parmi les isolats de la lignée clonale US-1 dans des populations des Pays-Bas (Drenth et al., 1994), du Pérou (Goodwin et al., 1995a), de Pologne (Sujkowski et al., 1991), du nord de l'Amérique du Nord (Goodwin et al., ., 1995b). Des différences dans le nombre de gènes de virulence de la pomme de terre ont également été notées parmi les isolats des lignées clonales US-7 et US-8 au Canada et aux États-Unis (Goodwin et al., 1995a), parmi les isolats de la lignée SIB-1 dans la partie asiatique de la Russie (Elansky et al, 2001 ).
Des isolats présentant de fortes différences dans les niveaux de résistance aux médicaments phénylamides ont été identifiés dans des populations de terrain monoclonales, qui appartenaient toutes à la lignée clonale Sib-1 (Elansky et al, 2001, tableau 1). Presque toutes les souches de la lignée clonale US-1 sont très sensibles au métalaxyl; cependant, des isolats très résistants de cette lignée ont été isolés aux Philippines (Koh et al., 1994) et en Irlande (Goodwin et al., 1996).
Populations modernes de P. infestans
Amérique centrale (Mexique)
La population de P. infestans au Mexique diffère nettement des autres populations mondiales, ce qui est principalement dû à sa position historique. De nombreuses études de cette population et des espèces apparentées de P. infestans du clade Phytophthora, ainsi que des espèces locales du genre Solanum, ont conduit à la conclusion que l'évolution de l'agent pathogène dans la partie centrale du Mexique a eu lieu avec l'évolution des plantes hôtes et était associée à la recombinaison sexuelle (Grünwald, Flier , 2005). Les deux types d'accouplement sont représentés dans la population, et en proportions égales, et la présence d'oospores dans le sol, sur les plantes et tubercules de pommes de terre et sur les espèces apparentées à la croissance sauvage Solanum confirme la présence d'un processus sexuel dans la population (Fernández-Pavía et al., 2002). Des études récentes de la vallée de Toluca et de ses environs (le centre d'origine présumé du pathogène) ont confirmé la grande diversité génétique de la population locale de P. infestans (134 génotypes multilocus sur un échantillon de 176 échantillons) et la présence de plusieurs sous-populations différenciées dans la région (Wang et al., 2017). Les facteurs contribuant à cette différenciation sont la division spatiale des sous-populations caractéristiques des hautes terres du centre du Mexique, les différences dans les conditions de culture et les variétés de pommes de terre utilisées dans les vallées et les montagnes, et la présence d'espèces tubéreuses sauvages de Solanum qui peuvent agir comme hôtes alternatifs (Fry et al. ., 2009).
Cependant, il convient de noter que les populations de P. infestans dans le nord du Mexique sont plutôt clonales et plus similaires aux populations nord-américaines, ce qui peut indiquer qu'il s'agit des nouveaux génotypes (Fry et al., 2009).
Amérique du Nord
Les populations nord-américaines de P. infestans ont toujours eu une structure très simple et leur caractère clonal a été établi bien avant l'utilisation de l'analyse microsatellitaire. Jusqu'en 1987, la lignée clonale US-1 dominait aux États-Unis et au Canada (Goodwin et al., 1995). Au milieu des années 70, lorsque les fongicides à base de métalaxyl sont apparus, ce clone a commencé à être remplacé par d'autres génotypes plus résistants qui ont migré du Mexique (Goodwin et al., 1998). À la fin des années 90. le génotype US-8 a complètement remplacé le génotype US-1 aux États-Unis et est devenu la lignée clonale dominante sur les pommes de terre (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). La situation était différente avec les tomates, qui contenaient constamment plusieurs lignées clonales, et leur composition changeait d'année en année (Fry et al., 2009).
En 2009, une épidémie à grande échelle de mildiou sur les tomates a éclaté aux États-Unis. Une caractéristique de cette pandémie était son apparition presque simultanée dans de nombreux endroits du nord-est des États-Unis, et elle s'est avérée être associée à des ventes massives de plants de tomates infectés dans les grandes jardineries (Fry et al., 2013). Les pertes de récolte étaient énormes. L'analyse microsatellitaire des échantillons affectés a révélé que la souche pandémique appartenait à la lignée clonale d'accouplement de type US-22 A2. En 2009, la part de ce génotype dans la population américaine de P. infestans a atteint 80% (Fry et al., 2013). Au cours des années suivantes, la proportion de génotypes agressifs US-23 (principalement sur les tomates) et US-24 (sur les pommes de terre) a augmenté régulièrement dans la population, cependant, après 2011, le taux de détection de l'US-24 a diminué de manière significative et, à ce jour, environ 90% de la population d'agents pathogènes dans Les États-Unis sont représentés par le génotype US-23 (Fry et al., 2015).
Au Canada, comme aux États-Unis, à la fin des années 90. le génotype dominant US-1 a été supplanté par US-8, dont les positions dominantes sont restées inchangées jusqu'en 2008. Au Canada, de graves épidémies de mildiou ont été associées à la vente de plants de tomates infectés, mais elles ont été causées par les génotypes US-2009 et US-2010 (Kalischuk et al., 23). La différenciation géographique claire de ces génotypes était remarquable: les États-Unis-8 dominaient les provinces de l'ouest du Canada (2012%), tandis que les États-Unis-23 dominaient les provinces de l'est (68%). Au cours des années suivantes, l'US-8 s'est répandu dans les régions de l'est; cependant, en général, sa part dans la population a légèrement diminué dans le contexte de l'apparition des génotypes US-83 et US-23 dans le pays (Peters et al., 22). À ce jour, US-24 maintient une position dominante dans tout le Canada; L'US-2014 est présent en Colombie-Britannique, tandis que l'US-23 et l'US-8 sont présents en Ontario (Peters, 23).
Ainsi, les populations nord-américaines de P. infestans sont principalement des lignées clonales. Au cours des 40 dernières années, le nombre de génotypes clonaux détectés a atteint 24. Bien que des souches des deux types d'accouplement soient présentes dans la population, la probabilité d'apparition de nouveaux génotypes à la suite d'une recombinaison sexuelle reste assez faible. Néanmoins, au cours des 20 dernières années, plusieurs cas d'apparition de populations éphémères recombinantes ont été enregistrés (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), et dans un cas, le résultat du croisement était le génotype US-11 , qui a été ancrée en Amérique du Nord pendant de nombreuses années (Gavino et al., 2000). Jusqu'en 2009, les changements dans la structure des populations étaient associés à l'émergence de nouveaux génotypes plus agressifs avec leur migration ultérieure et le déplacement de prédécesseurs précédemment dominants. Ce qui s'est passé en 2009-2010 Aux États-Unis et au Canada, les épiphytotiques ont pour la première fois montré qu'à l'ère de la mondialisation, les foyers de la maladie peuvent être associés à la propagation active de nouveaux génotypes lors de la vente de matériel végétal infecté.
Amérique du Sud
Jusqu'à récemment, les études des populations sud-américaines de P. infestans n'étaient ni régulières ni à grande échelle. On sait que la structure de ces populations est assez simple et comprend 1 à 5 lignées clonales par pays (Forbes et al., 1998). Ainsi, en 1998, les génotypes US-1 (Brésil, Chili) BR-1 (Brésil, Bolivie, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Équateur, Colombie, Pérou et Venezuela), AR-1, AR ont été trouvés sur des pommes de terre -2, AR-3, AR-4 et AR-5 (Argentine), PE-3 et PE-7 (sud du Pérou). L'accouplement de type A2 était présent au Brésil, en Bolivie et en Argentine et n'a pas été trouvé au-delà de la frontière bolivo-péruvienne dans la région du lac Titicaca, derrière lequel le génotype EC-1 A1 dominait dans les Andes. Sur les tomates, US-1 est resté le génotype dominant dans toute l'Amérique du Sud.
La situation a plus ou moins persisté dans les années 2000. Un point important a été la découverte dans les Andes septentrionales sur des pommes de terre apparentées sauvages (S. brevifolium et S. tetrapetalum) d'une nouvelle lignée clonale EC-2 de type A2 (Oliva et al., 2010). Des études phylogénétiques ont montré que cette lignée n'est pas complètement identique à P. infestans, bien qu'elle lui soit étroitement liée, à propos de laquelle il a été proposé de la considérer, ainsi qu'une autre lignée, EC-3, isolée du tomate S. betaceum poussant dans les Andes, une nouvelle espèce appelée P. andina; cependant, le statut de cette espèce (une espèce indépendante ou un hybride de P. infestans avec une lignée encore inconnue) n'est toujours pas clair (Delgado et al., 2013).
Actuellement, toutes les populations sud-américaines de P. infestans sont clonales. Malgré la présence des deux types d'accouplement, aucune population recombinante n'a été identifiée. Sur les tomates, le génotype US-1 est omniprésent, apparemment déplacé des pommes de terre par des souches locales, dont l'origine exacte est encore inconnue. Au Brésil, en Bolivie et en Uruguay, le génotype BR-1 est présent; au Pérou, avec US-1 et EC-1, il existe plusieurs autres génotypes locaux. Dans les Andes, la position dominante est conservée par la lignée clonale EC-1, dont la relation avec le P. andina récemment découvert reste inexplorée. Le seul endroit "instable" où pour la période 2003-2013. il y avait des changements importants dans la population, est devenu le Chili (Acuña et al., 2012), où en 2004-2005. la population d'agents pathogènes s'est caractérisée par une résistance au métalaxyl et un nouvel haplotype d'ADN mitochondrial (Ia au lieu de Ib précédemment présent). 2006 à 2011 Dans la population, le génotype 21 (selon SSR) a dominé, dont la part a atteint 90%, après quoi le palmier est passé au génotype 20, dont la fréquence d'apparition au cours des deux années suivantes a été maintenue à environ 67% (Acuña, 2015).
Europe
Dans l'histoire de l'Europe, il y a eu au moins deux vagues de migration de P. infestans d'Amérique du Nord: au 1e siècle. (HERB-1) et au début du XXe siècle (US-70). La distribution omniprésente des fongicides contenant du métalaxyl dans les années 1. conduit au déplacement du génotype dominant US-XNUMX et à son remplacement par de nouveaux génotypes. En conséquence, dans la plupart des pays d'Europe occidentale, les populations du pathogène étaient principalement représentées par plusieurs lignées clonales.
L'utilisation de l'analyse microsatellitaire pour l'analyse des populations de pathogènes a permis d'identifier de graves changements survenus en Europe de l'Ouest en 2005-2008. En 2005, une nouvelle lignée clonale a été découverte au Royaume-Uni, appelée 13_A2 (ou «Blue 13») et caractérisée par le type d'accouplement A2 , forte agressivité et résistance aux phénylamides (Shaw et al., 2007). Le même génotype a été trouvé dans des échantillons prélevés en 2004 aux Pays-Bas et dans le nord de la France, ce qui suggère qu'il a migré vers le Royaume-Uni depuis l'Europe continentale, probablement avec des pommes de terre de semence (Cooke et al., 2007). L'étude du génome des représentants de cette lignée clonale a montré un degré élevé de polymorphisme de sa séquence (en 2016, le nombre de ses variations sous-clonales atteignait 340) et un degré significatif de variation du niveau d'expression génique, incl. gènes effecteurs lors d'une infection végétale (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Ces caractéristiques, ainsi que la durée accrue de la phase biotrophique, pourraient entraîner une agressivité accrue du 13_A2 et sa capacité à infecter même les variétés de pommes de terre résistantes au mildiou.
Au cours des années suivantes, le génotype s'est rapidement répandu dans les pays du nord-ouest de l'Europe (Grande-Bretagne, Irlande, France, Belgique, Pays-Bas, Allemagne) avec le déplacement simultané des génotypes précédemment dominants 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Selon le site www.euroblight.net, la part de 13_A2 dans les populations de ces pays a atteint 60-80% et plus; la présence de ce génotype a également été signalée dans certains pays d'Europe orientale et méridionale. Cependant, en 2009-2012. 13_A2 a perdu ses positions dominantes en Grande-Bretagne et en France, cédant à la lignée 6_A1 (8_A1 en Irlande), et aux Pays-Bas et en Belgique, il a été partiellement remplacé par les génotypes 1_A1, 6_A1 et 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
À ce jour, environ 70% de la population d'Europe occidentale de P. infestans est monoclonale. D'après le site www.euroblight.net, les génotypes dominants dans les pays du nord-ouest de l'Europe (Royaume-Uni, France,
Pays-Bas, Belgique) restent, à peu près dans des proportions égales, 13_A2 et 6_A1, et ce dernier ne se produit pratiquement pas en dehors de la région spécifiée (à l'exception de l'Irlande), mais compte déjà au moins 58 sous-clones (Cooke, 2017). Les variations 13_A2 sont présentes en nombre notable en Allemagne, et sont également observées sporadiquement dans les pays d'Europe centrale et méridionale. Le génotype 1_A1 constitue une part importante des populations de la Belgique et partiellement des Pays-Bas et de la France. Le génotype 8_A1 s'est stabilisé dans la population européenne au niveau de 3-6%, à l'exception de l'Irlande, où il conserve sa position de leader et est divisé en deux sous-clones (Stellingwerf, 2017). Enfin, en 2016, une augmentation de la fréquence d'apparition des nouveaux génotypes 36_A2 et 37_A2, enregistrés pour la première fois en 2013-2014, a été notée; à ce jour, ces génotypes se trouvent aux Pays-Bas et en Belgique et en partie en France et en Allemagne, ainsi que dans le sud de la Grande-Bretagne (Cooke, 2017). Environ 20 à 30% de la population d'Europe occidentale est représentée par des génotypes uniques chaque année.
Contrairement à l'Europe occidentale, au moment où le génotype 13_A2 est apparu, les populations d'Europe du Nord (Suède, Norvège, Danemark, Finlande) n'étaient pas représentées par des lignées clonales, mais par un grand nombre de génotypes uniques (Brurberg et al.,
2011). Pendant la période de dissémination active du 13_A2 en Europe occidentale, la présence de ce génotype en Scandinavie n'a été notée qu'en 2011, date à laquelle il a été découvert pour la première fois dans le Jutland du Nord (Danemark), où des variétés de pommes de terre principalement industrielles sont cultivées avec l'utilisation active de métaux contenant du métalaxyl fongicides (Nielsen et al., 2014). Selon www.euroblight.net, le génotype 13_A2 a également été détecté dans plusieurs échantillons de Norvège et du Danemark en 2014 et dans plusieurs échantillons norvégiens en 2016; de plus, en 2013, la présence du génotype 6_A1 en petite quantité a été notée en Finlande. La principale raison de l'échec de 13_A2 et d'autres lignées clonales dans la conquête de la Scandinavie est considérée comme étant les différences climatiques de cette région par rapport aux pays d'Europe occidentale.
Outre le fait que les étés frais et les hivers froids contribuent à la survie des oospores plutôt que du mycélium végétatif (Sjöholm et al., 2013), le gel du sol en hiver (qui ne se produit généralement pas dans les pays plus chauds d'Europe occidentale) contribue à la synchronisation de la germination et de la plantation des oospores. pomme de terre, ce qui renforce leur rôle en tant que source de primo-infection (Brurberg et al., 2011). Il convient également de noter que, dans les conditions nordiques, le développement de l'infection à partir des oospores dépasse le développement de l'infection tubéreuse, ce qui empêche finalement la domination de lignées clonales encore plus agressives, mais développées plus tard (Yuen, 2012). La structure des populations de P. infestans les plus étudiées en Europe de l'Est (Pologne, États baltes) est très similaire à celle de la Scandinavie.
Les deux types d'accouplement sont également présents ici, et la grande majorité des génotypes déterminés par l'analyse SSR sont uniques (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Comme en Europe du Nord, la distribution des lignées clonales (principalement du génotype 13_A2) n'a pratiquement pas affecté les populations locales du pathogène, qui conservent un haut niveau de diversité avec l'absence de lignées dominantes prononcées.
La présence de 13_A2 est parfois observée dans les champs avec des variétés de pommes de terre commerciales. En Russie, la situation évolue de manière similaire. Analyse microsatellitaire des isolats de P. infestans collectés en 2008-2011 dans 10 régions différentes de la partie européenne de la Russie, ont montré un degré élevé de diversité génotypique et une absence totale de coïncidences avec les lignées clonales européennes (Statsyuk et al., 2014). Plusieurs années plus tard, une étude d'échantillons de P. infestans collectés dans la région de Leningrad en 2013-2014 a montré des différences significatives entre eux et les génotypes de cette région identifiés dans l'étude précédente. Dans les deux études, aucun génotype d'Europe occidentale n'a été trouvé (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
La grande diversité génétique des populations d'Europe de l'Est de P. infestans et l'absence de lignées clonales dominantes peuvent être dues à plusieurs raisons. Premièrement, comme en Europe du Nord, les conditions climatiques des pays considérés contribuent à la formation d'oospores comme principale source d'infection (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Deuxièmement, une part importante des pommes de terre produites dans ces pays est cultivée dans de petites exploitations privées, souvent entourées de forêts ou d'autres obstacles à la libre circulation des matières infectieuses (Chmielarz et al., 2014). En règle générale, les pommes de terre cultivées dans de telles conditions ne sont pratiquement pas traitées avec des produits chimiques et le choix des variétés est basé sur leur résistance au mildiou, c.-à-d. il n'y a pas de pression sélective pour l'agressivité et la résistance au métalaxyl, qui prive les génotypes résistants, tels que 13_A2, d'avantages par rapport aux autres génotypes (Chmielarz et al., 2014). Enfin, en raison de la petite taille des parcelles, leurs propriétaires ne pratiquent généralement pas la rotation des cultures, cultivant des pommes de terre au même endroit pendant des années, ce qui contribue à l'accumulation d'un inoculum génétiquement diversifié (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asie
Jusqu'à récemment, la structure des populations de P. infestans en Asie restait relativement mal comprise. On savait qu'elle est représentée principalement par des lignées clonales et que l'effet de la recombinaison sexuelle sur l'émergence de nouveaux génotypes est très faible. Ainsi, par exemple, en 1997-1998. Dans la partie asiatique de la Russie (Sibérie et Extrême-Orient), la population de pathogènes était représentée par seulement trois génotypes avec une prédominance du génotype SIB-1 (Elansky et al., 2001). La présence de lignées d'agents pathogènes clonaux a été mise en évidence dans des pays comme la Chine, le Japon, la Corée, les Philippines et Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). La lignée clonale US-1 a dominé un vaste territoire asiatique à la fin des années 90 - début des années 2000. presque partout ont commencé à être remplacés par d'autres génotypes qui, à leur tour, ont cédé la place à de nouveaux. Dans la plupart des cas, les changements dans la structure et la composition des populations des pays asiatiques étaient associés à la migration de nouveaux génotypes de l'extérieur. Ainsi, au Japon, à l'exception du génotype JP-3, tous les autres génotypes japonais apparus après US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) ont une origine externe plus ou moins prouvée (Akino et al., 2011) ... Il existe actuellement trois principales populations d'agents pathogènes en Chine, avec une division géographique claire; Il n'y a pas ou très peu de flux de gènes entre ces populations (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Le génotype 13_A2 est apparu sur le territoire de la Chine dans ses provinces du sud (Yunnan et Sichuan) en 2005-2007, et en 2012-1014. a également été observée dans le nord-est du pays (Li et al., 2013b). En Inde, 13_A2 est apparu vraisemblablement en même temps qu'en Chine, probablement avec des pommes de terre de semence infectées (Chowdappa et al., 2015), et en 2009-2010. a provoqué une maladie épiphytotique grave de mildiou sur la tomate dans le sud du pays, après quoi elle s'est propagée aux pommes de terre et a provoqué en 2014 une épidémie de mildiou au Bengale occidental, qui a conduit à la ruine et au suicide de nombreux agriculteurs locaux (Fry, 2016).
Afrique
Jusqu'en 2008-2010 des études systématiques sur P. infestans dans les pays africains n'ont pas été réalisées. Actuellement, les populations africaines de P. infestans peuvent être divisées en deux groupes, et cette division est clairement associée au fait de l'importation de pommes de terre de semence en provenance d'Europe.
En Afrique du Nord, qui importe activement des plants de pommes de terre d'Europe, le type d'accouplement A2 est largement représenté dans presque toutes les régions, ce qui offre une possibilité théorique d'émergence de nouveaux génotypes à la suite de la recombinaison sexuelle (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). De plus, en Algérie, la présence des génotypes 13_A2, 2_A1 et 23_A1 est notée avec une dominance prononcée du premier d'entre eux, ainsi qu'une diminution progressive de la proportion de génotypes uniques jusqu'à disparition complète (Rekad et al., 2017). Contrairement au reste de la région, en Tunisie (à l'exception du nord-est du pays), la population pathogène est représentée principalement par le type d'accouplement A1 (Harbaoui et al., 2014).
La lignée clonale NA-01 est ici dominante. En général, la proportion de lignées clonales dans la population n'est que de 43%. En Afrique orientale et australe, où le volume des importations de semences est extrêmement faible (Fry et al., 2009), P. infestans n'est représenté que par deux lignées clonales de type A1, US-1 et KE-1, et la seconde déplace activement la première sur les pommes de terre ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). À ce jour, ces deux génotypes présentent un nombre notable de variations sous-clonales.
Australie
Le premier signalement de mildiou sur les pommes de terre en Australie remonte à 1907, et le premier épiphytote, vraisemblablement causé par de fortes pluies pendant les mois d'été, s'est produit en 1909-1911. (Drenth et al., 2002). En général, cependant, le mildiou n'a pas de signification économique significative pour le pays. Des foyers sporadiques de mildiou, provoqués par des conditions météorologiques qui fournissent une humidité élevée, ne se produisent pas plus d'une fois tous les 5 à 7 ans et sont localisés principalement dans le nord de la Tasmanie et le centre de Victoria. En relation avec ce qui précède, les publications consacrées à l'étude de la structure de la population australienne de P. infestans sont pratiquement absentes. Les dernières informations disponibles datent de 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Selon les auteurs, la population de Victoria était une lignée clonale US-1.3, ce qui confirmait indirectement la migration de ce génotype depuis les États-Unis. Les spécimens de Tasmanie ont été classés dans le type AU-3, différent des génotypes qui étaient présents à cette époque dans d'autres parties du monde.
Caractéristiques du développement du mildiou en Russie
En Europe, l'infection a été introduite par des tubercules de semence malades, des oospores qui ont hiverné dans le sol, ainsi que des zoosporanges apportés par le vent à partir de plantes cultivées à partir de tubercules hivernés dans les champs de l'année dernière (plantes «volontaires»), ou sur des tas de signet pour le stockage des tubercules. Parmi ceux-ci, les plantes cultivées sur des tas de tubercules jetés sont considérées comme la source d'infection la plus dangereuse. là, le nombre de tubercules germés est souvent important et les zoosporanges peuvent en être transportés sur de longues distances. Les autres sources (oospores, plantes «volontaires») ne sont pas si dangereuses, car il n'est pas habituel de cultiver des plantes dans les mêmes champs plus d'une fois tous les 3-4 ans. L'infection par des tubercules de semences malades est également minime grâce à un bon système de contrôle de la qualité des semences.
En général, la quantité d'inoculum dans les populations européennes est limitée et, par conséquent, l'augmentation de l'épidémie est plutôt lente et peut être maîtrisée avec succès à l'aide de préparations fongicides chimiques. La tâche principale dans les conditions européennes est la lutte contre l'infection dans la phase où commence la dispersion massive des zoosporanges des plantes atteintes.
En Russie, la situation est radicalement différente. La plupart des cultures de pommes de terre et de tomates sont cultivées dans de petits jardins privés; soit aucune mesure de protection n'est appliquée sur eux, soit les traitements fongicides sont effectués en nombre insuffisant et commencent après l'apparition du mildiou sur les sommets. En conséquence, les jardins potagers privés constituent la principale source d'infection, à partir de laquelle les zoosporanges sont transportés par le vent vers les plantations commerciales. Ceci est confirmé par nos observations directes dans les régions de Moscou, Bryansk, Kostroma, Ryazan: des dommages aux plantes des jardins privés sont observés avant même le début des traitements fongicides des plantations commerciales. Par la suite, l'épidémie dans les grands champs est freinée par l'utilisation de préparations fongicides, tandis que dans les jardins privés, le mildiou se développe rapidement.
En cas de traitements inappropriés ou "budgétaires" des plantations commerciales, des foyers de mildiou apparaissent également dans les champs; plus tard, ils se développent activement, couvrant des zones de plus en plus vastes (Elansky, 2015). L'infection dans les jardins privés a un impact significatif sur les épidémies dans les champs commerciaux. Dans toutes les régions productrices de pommes de terre de Russie, la superficie occupée par les pommes de terre dans les jardins privés est plusieurs fois supérieure à la superficie totale des champs des grands producteurs. Dans un tel environnement, les jardins potagers privés peuvent être considérés comme une ressource mondiale d'inoculum pour les champs commerciaux. Essayons d'identifier les propriétés caractéristiques des génotypes de souches dans les jardins privés.
La plantation de pommes de terre de consommation sans semences et le contrôle de quarantaine, les semences de tomates obtenues auprès de producteurs étrangers douteux, la culture à long terme de pommes de terre et de tomates sur les mêmes zones, les traitements fongicides inappropriés ou leur absence totale conduisent à de graves épiphytoties dans le secteur privé, dont le résultat est gratuit croisement, hybridation et formation d'oospores dans les jardins privés. En conséquence, une très grande diversité génotypique du pathogène est observée, lorsque presque chaque souche est unique dans son génotype (Elansky et al., 2001, 2015). La plantation de pommes de terre de semence de diverses origines génétiques rend improbable l'émergence de lignées clonales spécialisées pour attaquer une variété particulière. Les souches sélectionnées dans un tel cas se distinguent par leur polyvalence par rapport aux variétés affectées, la plupart d'entre elles ont un nombre proche du maximum de gènes de virulence. Ceci est très différent du système de «lignées clonales» typique des grands champs des entreprises agricoles avec un système de protection correctement installé contre le mildiou. Les «lignées clonales» (lorsque toutes les souches de l'agent pathogène du mildiou sur le terrain sont représentées par un ou plusieurs génotypes) sont omniprésentes dans les pays où la culture de la pomme de terre est réalisée exclusivement par de grandes exploitations: États-Unis, Pays-Bas, Danemark, etc. En Angleterre, en Irlande, en Pologne, où les ménages culture de la pomme de terre, la diversité génotypique est également plus élevée dans les jardins privés. À la fin du 20e siècle, les «lignées clonales» étaient répandues dans les régions d'Asie et d'Extrême-Orient de la Russie (Elansky et al., 2001), ce qui est apparemment dû à l'utilisation des mêmes variétés de pommes de terre exclusivement pour la plantation. Récemment, la situation dans ces régions a également commencé à évoluer vers une augmentation de la diversité génotypique des populations.
L'absence de traitements intensifs avec des préparations fongicides a une autre conséquence directe: il n'y a pas d'accumulation de souches résistantes dans les jardins. En effet, nos résultats montrent que les souches résistantes au métalaxyl se retrouvent beaucoup moins fréquemment dans les jardins privés que dans les plantations commerciales.
La proximité des plantations de pommes de terre et de tomates, typique des jardins privés, facilite la migration des souches entre ces cultures, de sorte que, au cours de la dernière décennie, parmi les souches isolées de pommes de terre, la proportion de souches porteuses du gène de résistance aux variétés de tomates cerises (T1), auparavant caractéristique uniquement de souches de tomates. Dans la plupart des cas, les souches avec le gène T1 sont très agressives envers les pommes de terre et les tomates.
Ces dernières années, le mildiou sur la tomate a commencé à apparaître dans de nombreux cas plus tôt que sur les pommes de terre. Les plants de tomates peuvent être infestés d'oospores dans le sol ou d'oospores présentes dans les graines de tomates ou adhérant à celles-ci (Rubin et al., 2001). Au cours des 15 dernières années, un grand nombre de semences conditionnées bon marché, principalement importées, sont apparues dans les magasins et la plupart des petits producteurs sont passés à les utiliser. Les graines peuvent contenir des souches avec des génotypes typiques des régions de leur culture. À l'avenir, ces génotypes sont inclus dans le processus sexuel dans les jardins privés, ce qui conduit à l'émergence de génotypes complètement nouveaux.
Ainsi, on peut affirmer que les jardins privés sont un «melting pot» mondial dans lequel, à la suite de l'échange de matériel génétique, des génotypes existants sont traités et de tout nouveaux apparaissent. De plus, leur sélection se déroule dans des conditions très différentes de celles créées pour la pomme de terre dans les grandes exploitations: l'absence de presse fongicide, l'uniformité variétale des plantations, la prédominance des plantes touchées par diverses formes d'infection virale et bactérienne, la proximité des tomates et des morelles sauvages, le croisement actif et la formation d'oospores, la possibilité pour que les oospores agissent comme une source d’infection pour l’année prochaine.
Tout cela conduit à une très grande diversité génotypique des populations des ménages. Dans les conditions d'épiphytose des jardins potagers, le mildiou se propage très rapidement et d'énormes quantités de spores sont libérées, volant vers les plantations commerciales voisines. Cependant, étant entrées dans les champs commerciaux avec le bon système de technologie agricole et de protection chimique, les spores qui sont arrivées n'ont pratiquement aucune possibilité d'initier des épiphytotiques sur le terrain, ce qui est dû à l'absence de lignées clonales résistantes aux fongicides et spécialisées dans la variété cultivée.
Une autre source d'inoculum primaire peut être des tubercules malades piégés dans des plants commerciaux. Ces tubercules étaient cultivés, en règle générale, dans des champs dotés d'une bonne technologie agricole et d'une protection chimique intensive. Les génotypes des isolats qui infectent les tubercules sont adaptés au développement de leur propre variété. Ces souches sont nettement plus dangereuses pour la plantation commerciale que l'inoculum provenant de jardins privés. Les résultats de nos recherches soutiennent également cette hypothèse. Les populations isolées de grands champs avec une protection chimique correctement menée et une bonne technologie agricole ne diffèrent pas par une grande diversité génotypique. Il s'agit souvent de plusieurs lignées clonales très agressives.
Les souches de semences commerciales peuvent pénétrer dans les populations des jardins potagers et être impliquées dans les processus qui s'y déroulent. Cependant, dans un potager, leur compétitivité sera beaucoup plus faible que dans un domaine commercial, et bientôt ils cesseront d'exister sous la forme d'une lignée clonale, mais leurs gènes pourront être utilisés dans la population «jardinière».
L'infection qui se développe sur les plantes «spontanées» et sur les tas de tubercules abattus pendant la récolte n'est pas si pertinente pour la Russie, car Dans les principales régions productrices de pommes de terre de Russie, on observe un gel profond du sol en hiver et des plantes de tubercules qui ont hiverné dans le sol se développent rarement. De plus, comme le montrent nos expériences, le pathogène du mildiou ne survit pas à des températures négatives même sur des tubercules qui ont conservé leur viabilité. Dans la zone aride, où la culture de la pomme de terre primitive est pratiquée, le mildiou est assez rare en raison de la saison de croissance sèche et chaude.
Ainsi, nous observons actuellement la division des populations de P. infestans en populations «champ» et «jardin». Cependant, ces dernières années, des processus ont été observés conduisant à la convergence et à l'interpénétration des génotypes de ces populations.
Parmi eux, on peut noter une augmentation générale de l'alphabétisation des petits producteurs, l'émergence de petits conditionnements abordables de pommes de terre de semence, la diffusion de préparations fongicides en petits conditionnements, et la perte de la peur de la «chimie» par la population.
Des situations surviennent lorsque, grâce à l'activité vigoureuse d'un fournisseur, des villages entiers sont plantés avec des tubercules de semence de la même variété et munis de petits emballages des mêmes pesticides. On peut supposer que des pommes de terre de la même variété se trouveront dans les plantations commerciales à proximité.
D'un autre côté, certaines sociétés commerciales de pesticides encouragent des programmes de traitement chimique «budgétaires». Dans ce cas, le nombre de traitements recommandés est sous-estimé et les fongicides les moins chers sont proposés, et l'accent n'est pas mis sur la prévention du développement du mildiou jusqu'à la tonte des sommets, mais sur un certain retard de l'épiphytotie afin d'augmenter le rendement. De tels régimes sont économiquement justifiés lors de la culture de pommes de terre de consommation à partir de semences de qualité inférieure, alors qu'en principe il n'est pas question d'obtenir un rendement élevé. Cependant, dans ce cas, contrairement aux populations potagères, le fond génétique nivelé de la pomme de terre contribue à la sélection de races physiologiques spécifiques, très dangereuses pour cette variété.
En général, les tendances à la convergence des méthodes de production de pommes de terre «jardin» et «champ» nous semblent plutôt dangereuses. Pour éviter leurs conséquences négatives, tant dans le secteur domestique que commercial, il sera nécessaire de contrôler à la fois l'assortiment de pommes de terre de semence et la gamme de fongicides proposés aux propriétaires privés dans de petits emballages, ainsi que le suivi des régimes de protection des pommes de terre et l'utilisation de préparations fongicides dans le secteur commercial.
Dans les zones du secteur privé, il y a un développement intensif non seulement du mildiou, mais aussi de l'Alternaria. La plupart des propriétaires de fermes privées ne prennent pas de mesures spéciales pour se protéger contre Alternaria, confondant le développement de l'Alternaria avec le flétrissement naturel du feuillage ou le développement du mildiou. Par conséquent, avec le développement massif d'Alternaria sur les variétés sensibles, les parcelles familiales peuvent servir de source d'inoculum pour les plantations commerciales.
Mécanismes de variabilité
Processus de mutation
L'occurrence de mutations étant un processus aléatoire se déroulant avec une faible fréquence, l'apparition de mutations à n'importe quel locus dépend de la fréquence de mutation de ce locus et de la taille de la population. Lors de l'étude de la fréquence des mutations des souches de P. infestans, le nombre de colonies cultivées sur des milieux nutritifs sélectifs après traitement avec des mutagènes chimiques ou physiques est généralement déterminé. Comme on peut le voir d'après les données présentées dans le tableau 8, la fréquence de mutation de la même souche à différents loci peut différer de plusieurs ordres de grandeur. La fréquence élevée des mutations de la résistance au métalaxyl peut être l'une des raisons de l'accumulation de souches résistantes à celui-ci dans la nature.
La fréquence des mutations spontanées ou induites, calculée sur la base d'expériences de laboratoire, ne correspond pas toujours aux processus intervenant dans les populations naturelles, pour les raisons suivantes:
1. Avec les fissions nucléaires asynchrones, il est impossible d'estimer la fréquence des mutations par génération nucléaire. Par conséquent, la plupart des expériences ne fournissent des informations que directement sur la fréquence des mutations, sans faire la distinction entre deux événements mutationnels et un événement suivant la mitose.
2. Les mutations en une seule étape réduisent généralement l'équilibre du génome, par conséquent, parallèlement à l'acquisition d'une nouvelle propriété, l'aptitude générale de l'organisme diminue. La plupart des mutations obtenues expérimentalement ont une agressivité réduite et ne sont pas enregistrées dans les populations naturelles. Ainsi, le coefficient de corrélation entre le degré de résistance des mutants de P. infestans aux fongicides phénylamides et le taux de croissance en milieu artificiel était en moyenne (-0,62), et la résistance aux fongicides et l'agressivité sur les feuilles de pomme de terre (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), ce qui indique la faible aptitude des mutants. Les mutations de résistance au diméthomorphe étaient également accompagnées d'une forte diminution de la viabilité (Bagirova et al., 2001).
3. La majorité des mutations spontanées et induites sont récessives et ne se manifestent pas phénotypiquement dans les expériences, mais constituent une réserve cachée de variabilité dans les populations naturelles. Les souches mutantes isolées dans des expériences de laboratoire portent des mutations dominantes ou semi-dominantes (Kulish et Dyakov, 1979). Apparemment, la diploïdie nucléaire explique les tentatives infructueuses d'obtenir des mutants sous l'influence de l'irradiation UV qui sont virulents sur des variétés auparavant résistantes (McKee, 1969). Selon les calculs de l'auteur, de telles mutations peuvent se produire avec une fréquence inférieure à 1: 500000 XNUMX. La transition des mutations récessives vers un état homozygote exprimé phénotypiquement peut se produire en raison d'une recombinaison sexuelle ou asexuée (voir ci-dessous). Cependant, même dans ce cas, la mutation peut être masquée par les allèles dominants des noyaux de type sauvage dans le mycélium cénotique (multinucléé) et fixée phénotypiquement uniquement lors de la formation de zoospores mononucléaires.
Tableau 8. Fréquence des mutations de P. infestans en substances inhibant la croissance sous l'action de la nitrosométhylurée (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Lien | Fréquence de mutation |
Oxytétracycline | 6,9 10 x-8 |
Blasticidine S | 7,2 x 10-8 |
Streptomycine | 8,3 x10-8 |
Trichothécine | 1,8 10 x-8 |
Cycloheximide | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Diméthomorphe | 6,3 10 x-7 |
Métalaxil | 6,9 10 x-6 |
La taille des populations joue également un rôle décisif dans l'apparition de mutations spontanées. Dans les très grandes populations, dans lesquelles le nombre de cellules N> 1 / a, où a est le taux de mutation, la mutation cesse d'être un phénomène aléatoire (Kvitko, 1974).
Les calculs montrent qu'avec une infestation moyenne d'un champ de pommes de terre (35 spots par plant), 8x1012 spores se forment quotidiennement sur un hectare (Dyakov et Suprun, 1984). Apparemment, ces populations contiennent toutes les mutations autorisées par le type d'échange à chaque locus. Même une mutation rare, survenant avec une fréquence de 10-9, sera acquise par un millier d'individus sur des millions vivant sur un hectare d'un champ de pommes de terre. Pour les mutations se produisant avec une fréquence plus élevée (par exemple, 10-6), dans une telle population, diverses mutations appariées peuvent se produire quotidiennement (simultanément à deux locus), c.-à-d. le processus de mutation remplacera la recombinaison.
Migrations
Pour P. infestans, deux principaux types de migration sont connus: vers des distances proches (dans un champ de pommes de terre ou des champs voisins) en répandant des zoosporanges par les courants d'air ou les embruns, et sur de longues distances - avec la plantation de tubercules ou les tomates transportées. La première méthode prévoit l'expansion du foyer de la maladie, la seconde - la création de nouveaux foyers dans des endroits éloignés du primaire.
La propagation de l'infection par les tubercules et les fruits de tomates contribue non seulement à l'émergence de la maladie dans de nouveaux endroits, mais est également la principale source de diversité génétique des populations. Dans la région de Moscou, les pommes de terre sont cultivées, importées de différentes régions de Russie et d'Europe occidentale. Les fruits de la tomate sont importés des régions du sud de la Russie (région d'Astrakhan, territoire de Krasnodar, Caucase du Nord). Les graines de tomates, qui peuvent également servir de sources d'infection (Rubin et al., 2001), sont également importées des régions méridionales de la Russie, de la Chine, des pays européens et d'autres pays.
Selon les calculs d'E. Mayr (1974), les changements génétiques dans une population locale causés par des mutations dépassent rarement 10-5 par locus, alors que dans les populations ouvertes, l'échange dû au contre-courant des gènes est d'au moins 10-3-10-4.
La migration des tubercules infectés est responsable de l'entrée de P. infestans en Europe, se propageant à toutes les régions du monde où les pommes de terre sont cultivées; ils ont causé les changements de population les plus graves. Le mildiou des pommes de terre est apparu sur le territoire de l'empire russe presque simultanément avec son apparition en Europe occidentale.
Étant donné que la maladie a été notée pour la première fois en 1846-1847 dans les États baltes et ne s'est propagée que les années suivantes en Biélorussie et dans les régions du nord-ouest de la Russie, son origine en Europe occidentale est évidente. La première source de mildiou dans l'Ancien Monde n'est pas si évidente. L'hypothèse développée par Fry et al. (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) suggère que le parasite est d'abord venu du Mexique en Amérique du Nord, où il s'est propagé à travers les cultures, puis a été transporté en Europe occidentale. (fig.7).
En raison de la dérive répétée (double effet du «goulot d'étranglement»), des clones uniques sont arrivés en Europe, dont la progéniture a provoqué une pandémie sur tout le territoire de l'Ancien Monde où sont cultivées les pommes de terre. Comme preuve de cette hypothèse, les auteurs citent, d'une part, l'ubiquité d'un seul type d'accouplement (A1) et, d'autre part, l'homogénéité des génotypes des souches étudiées de différentes régions (toutes sont basées sur des marqueurs moléculaires, dont 2 loci isozymes, des schémas d'empreintes ADN, et la structure de l'ADN mitochondrial est identique, et correspond au clone US-1 décrit aux USA). Cependant, certaines données soulèvent des doutes sur au moins certaines des dispositions de l'hypothèse énoncée. L'analyse de l'ADN mitochondrial de P. infestans isolé à partir d'échantillons de pommes de terre d'herbier infectés au cours de la première période épiphytotique des années 40 a montré qu'ils diffèrent dans la structure de l'ADN mitochondrial du clone US-1, qui était donc au moins pas la seule source d’infection en Europe (Ristaino et al, 2001).
La situation du mildiou s'est à nouveau aggravée dans les années 80 du XXe siècle. Les changements suivants se sont produits:
1) L'agressivité moyenne de la population a augmenté, ce qui a conduit, en particulier, à une propagation généralisée de la forme la plus nocive de mildiou - les dommages aux pétioles et aux tiges.
2) Le moment d'apparition du mildiou sur les pommes de terre a changé - de la fin juillet au début juillet et même jusqu'à la fin juin.
3) Le type d'accouplement A2, qui était auparavant absent dans l'Ancien Monde, est devenu omniprésent.
Ces changements ont été précédés de deux événements: l'utilisation massive du nouveau fongicide métalaxyl (Schwinn et Staub, 1980) et l'émergence du Mexique comme exportateur mondial de pommes de terre (Niederhauser, 1993). En conséquence, deux raisons pour les changements de population ont été avancées: la conversion du type d'accouplement sous l'influence du métalaxyl (Ko, 1994) et l'introduction massive de nouvelles souches avec des tubercules infectés en provenance du Mexique (Fry et Goodwin, 1995). Bien que des interconversions de types d'accouplement sous l'influence du métalaxyl aient été obtenues non seulement par Ko, mais également dans des travaux menés au laboratoire de l'Université d'État de Moscou (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), la deuxième hypothèse est préférable. Parallèlement à l'apparition du deuxième type d'accouplement, de graves changements ont eu lieu dans les génotypes des souches russes de P. infestans, y compris dans les gènes neutres (loci isozyme et RFLP), ainsi que dans la structure de l'ADN mitochondrial. Le complexe de ces changements ne peut pas être expliqué par l'action du métalaxyl; il y a plutôt eu une importation massive de nouvelles souches du Mexique, qui, étant plus agressives (Kato et al., 1997), ont déplacé les anciennes souches (US-1), devenant dominantes dans les populations. Le changement dans la composition des populations européennes s'est produit en très peu de temps - de 1980 à 1985 (Fry et al., 1992). Sur le territoire de l'ex-URSS, des «nouvelles souches» ont été trouvées dans des collections d'Estonie en 1985, c'est-à-dire plus tôt qu'en Pologne et en Allemagne (Goodwin et al., 1994). La dernière fois que «l'ancienne souche US-1» en Russie a été isolée d'une tomate infectée dans la région de Moscou en 1993 (Dolgova et al., 1997). En France également, des souches «anciennes» ont été trouvées dans les plantations de tomates jusqu'au début des années 90, c'est-à-dire après avoir longtemps disparu sur les pommes de terre (Leberton et Andrivon, 1998). Les changements dans les souches de P. infestans ont affecté de nombreux caractères, y compris ceux d'une grande importance pratique, et ont augmenté la nocivité du mildiou.
Recombinaison sexuelle
Pour que la recombinaison sexuelle contribue à la variabilité, il est nécessaire, d'une part, la présence de deux types d'accouplement dans la population dans un rapport proche de 1: 1, et, d'autre part, la présence d'une variabilité initiale de la population.
Le rapport des types d'accouplement varie considérablement dans les différentes populations et même selon les années dans une population (tableau 9,10, 90). Les raisons de ces changements radicaux dans la fréquence des types d'accouplement dans les populations (comme, par exemple, en Russie ou en Israël au début des années 2002 du siècle dernier) sont inconnues, mais on pense que cela est dû à l'introduction de clones plus compétitifs (Cohen, XNUMX).
Certaines données indirectes indiquent le déroulement du processus sexuel certaines années et dans certaines régions:
1) Des études sur des populations de la région de Moscou ont montré que dans 13 populations dans lesquelles la part du type d'accouplement A2 était inférieure à 10%, la diversité génétique totale calculée pour trois loci isozymes était de 0,08, et dans 14 populations dans lesquelles la part d'A2 dépassait 30%, la diversité génétique était deux fois plus élevée (0,15) (Elansky et al., 1999). Ainsi, plus la probabilité de rapports sexuels est élevée, plus la diversité génétique de la population est grande.
2) La relation entre le rapport des types d'accouplement dans les populations et l'intensité de la formation d'oospores a été observée en Israël (Cohen et al., 1997) et en Hollande
(Flier et al., 2004). Nos études ont montré que dans les populations dans lesquelles les isolats avec le type d'accouplement A2 représentaient 62, 17, 9 et 6%, des oospores ont été trouvées dans 78, 50, 30 et 15% des feuilles de pomme de terre analysées (ayant 2 taches ou plus), respectivement.
Les échantillons avec 2 taches ou plus étaient beaucoup plus susceptibles de contenir des oospores que les échantillons avec 1 spot (32 et 14% des échantillons, respectivement) (Apryshko et al., 2004).
Les oospores étaient beaucoup plus fréquentes dans les feuilles des couches moyenne et inférieure du plant de pomme de terre (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Dans certaines régions, des génotypes uniques ont été découverts, dont la survenue est associée à une recombinaison sexuelle. Ainsi, en Pologne en 1989 et en France en 1990, des souches homozygotes pour le glucose-6-
phosphate isomérase (GPI 90/90). Comme auparavant, seuls 10/90 hétérozygotes étaient rencontrés pendant 100 ans, l'homozygotie est attribuée à la recombinaison sexuelle (Sujkowski et al., 1994). En Colombie (USA), les isolats combinant A2 avec GPI 100/110 et A1 avec GPI 100/100 sont courants, mais à la fin de la saison 1994 (16 août et 9 septembre), des souches avec des génotypes recombinants (A1 GPI 100/110 et A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Dans certaines populations de Pologne (Sujkowski et al., 1994) et du Caucase du Nord (Amatkhanova et al., 2004), la distribution des locus d'ADN des empreintes digitales et des locus de protéines allozymes correspond à la distribution de Hardy-Weinberg, ce qui indique
sur la part élevée de la contribution de la recombinaison sexuelle à la variabilité des populations. Dans d'autres régions de Russie, aucune correspondance avec la distribution de Hardy-Weinberg dans les populations n'a été trouvée, mais la présence d'un déséquilibre de liaison a été mise en évidence, indiquant la prédominance de la reproduction clonale (Elansky et al., 1999).
5) La diversité génétique (GST) entre les souches avec différents types d'accouplement (A1 et A2) était plus faible qu'entre différentes populations (Sujkowski et al., 1994), ce qui indique indirectement des croisements sexuels.
Dans le même temps, la contribution de la recombinaison sexuelle à la diversité de la population ne peut pas être très élevée. Cette contribution a été calculée pour les populations de la région de Moscou (Elansky et al., 1999). Selon les calculs de Lewontin (1979), "la recombinaison, qui peut produire de nouveaux variants à partir de deux loci avec une fréquence ne dépassant pas le produit de leurs hétérozygosités, ne devient efficace que si les valeurs d'hétérozygotie pour les deux allèles sont déjà élevées".
Avec le rapport des deux types d'appariement, qui est typique de la région de Moscou, égal à 4: 1, la fréquence de recombinaison sera de 0,25. La probabilité que les souches croisées soient hétérozygotes pour deux des trois loci isozygotes étudiés dans les populations étudiées était de 0,01 (2 souches sur 177). Par conséquent, la probabilité d'apparition de doubles hétérozygotes à la suite d'une recombinaison ne doit pas dépasser leur produit multiplié par la probabilité de croisement (0,25x0,02x0,02) = 10-4, soit les recombinants sexuels ne font généralement pas partie de l'échantillon de souches étudié. Ces calculs ont été effectués pour les populations de la région de Moscou, caractérisées par une variabilité relativement élevée. Dans les populations monomorphes comme celles de Sibérie, le processus sexuel, même s'il se produit dans des populations individuelles, ne peut pas influencer leur diversité génétique.
De plus, P. infestans est caractérisé par de fréquents désalignements chromosomiques lors de la méiose, ce qui conduit à une aneuploïdie (Carter et al., 1999). De telles violations réduisent la fertilité des hybrides.
Recombinaison parasexuelle, conversion de gène mitotique
Dans des expériences d'épissage de souches de P. infestans avec des mutations de résistance à différents inhibiteurs de croissance, l'émergence de misolates résistants aux deux inhibiteurs a été trouvée (Shattock et Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Des souches résistantes à deux inhibiteurs de croissance sont apparues à la suite de l'hétérocaryotisation du mycélium, et dans ce cas, elles se sont clivées pendant la reproduction par des zoospores mononucléaires (Judelson, Ge Yang, 1998), ou ne se sont pas clivées chez les descendants monozoosporeux, car elles avaient des noyaux tétraploïdes (puisque les isolats initiaux sont diploïdes) (K , 1979). Les diploïdes hétérozygotes se sont séparés à une fréquence très faible en raison de l'haploïdisation, de la non-disjonction chromosomique et du croisement mitotique (Poedinok et al., 1982). La fréquence de ces processus pourrait être augmentée à l'aide de certains effets sur les diploïdes hétérozygotes (par exemple, l'irradiation UV des spores en germination).
Bien que la formation d'hybrides végétatifs à double résistance se produise non seulement in vitro, mais aussi dans des tubercules de pomme de terre infectés par un mélange de mutants (Kulish et al., 1978), il est assez difficile d'évaluer le rôle de la recombinaison parasexuelle dans la génération de nouveaux génotypes dans les populations. La fréquence de formation de ségrégants due à l'haploïdisation, à la non-disjonction des chromosomes et au croisement mitotique sans effets spéciaux est négligeable (moins de 10-3).
L'apparition de ségrégants homozygotes de souches hétérozygotes peut être basée à la fois sur le croisement mitotique et la conversion du gène mitotique, qui chez P. sojae se produit avec une fréquence de 3 x 10-2 à 5 x 10-5 par locus, selon la souche (Chamnanpunt et al. , 2001).
Bien que la fréquence d'apparition des hétérocaryons et des diploïdes hétérozygotes se soit avérée étonnamment élevée (atteignant des dizaines de pour cent), ce processus se produit uniquement lorsque les cultures mutantes obtenues à partir de la même souche sont épissées. Lors de l'utilisation de différentes souches isolées de la nature, l'hétérocaryotisation ne se produit pas (ou se produit avec une fréquence très faible) en raison de la présence d'une incompatibilité végétative (Poedinok et Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Par conséquent, le rôle de la recombinaison parasexuelle ne peut être réduit qu'à la recombinaison intraclonale dans les noyaux hétérozygotes et à la transition de gènes individuels vers un état homozygote sans processus sexuel. Ce processus peut avoir une importance épidémiologique dans les souches présentant des mutations de résistance aux fongicides récessives ou semi-dominantes. Son passage à un état homozygote dû au processus parasexuel augmentera la résistance du porteur de la mutation (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgression de gènes
Les espèces hétérothalliques Phytophthora sont capables de se reproduire avec la formation d'oospores hybrides (voir Vorob'eva et Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). L'hybride naturel des deux espèces de Phytophthora était si agressif qu'il a tué des milliers d'aulnes au Royaume-Uni (Brasier et al., 1999). P. infestans peut être présent avec d'autres espèces du genre (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, etc.) sur des plantes hôtes communes et dans le sol, mais il y a peu d'informations dans la littérature sur la possibilité d'hybrides interspécifiques. Dans des conditions de laboratoire, des hybrides ont été obtenus entre P. infestans et P. Mirabilis (Goodwin et Fry, 1994).
Tableau 9. Proportion de souches de P. infestans avec un type d'accouplement A2 dans différents pays du monde entre 1990 et 2000 (d'après les données des sources et sites de littérature ouverte www.euroblight.net, www.eucablight.org)
pays | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Belarus | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgique | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Equateur | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonie | 8 (12) | ||||||||||
Angleterre | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finlande | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
France | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Hongrie | 72 (32) | ||||||||||
Irlande | 4 (145) | ||||||||||
Nord. Irlande | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Pays-Bas | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norvège | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Pérou | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Pologne | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Écosse | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Suède | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Pays de Galles | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Corée | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Chine | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Colombie | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroc | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexique (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tableau 10. Proportion de souches de P. infestans avec le type d'accouplement A2 dans différents pays du monde au cours de la période de 2000 à 2011
pays | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Autriche | 65 (83) | ||||||||||
Belarus | 42 (78) | ||||||||||
Belgique | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Suisse | 89 (19) | ||||||||||
République tchèque | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Allemagne | 95 (53) | ||||||||||
Danemark | 48 (52) | ||||||||||
Equateur | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonie | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Angleterre | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finlande | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
France | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Hongrie | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Nord. Irlande | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Pays-Bas | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norvège | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Pérou | 0 (36) | ||||||||||
Pologne | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Écosse | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Suède | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovaquie | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Pays de Galles | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Corée | 46 (26) | ||||||||||
Brésil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Chine | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Viêt-Nam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Ouganda | 0 (8) |
Dynamique de la composition génotypique des populations
Des changements dans la composition génotypique des populations de P. infestans peuvent survenir sous l'influence de la migration de nouveaux clones d'autres régions, des pratiques agricoles (changement de variétés, application de fongicides) et des conditions météorologiques. Les influences externes affectent différemment les clones à différents stades du cycle de vie; par conséquent, les populations subissent chaque année des changements cycliques dans la fréquence des gènes soumis à la sélection, en raison d'un changement du rôle prédominant de la dérive et de la sélection des gènes.
Influence de la variété
Les nouveaux cultivars dotés de gènes efficaces pour la résistance verticale (gènes R) sont un puissant facteur de sélection qui sélectionne les clones avec des gènes de virulence complémentaires dans les populations de P. infestans. En l'absence de résistance non spécifique dans la variété de pomme de terre qui inhibe la croissance de la population pathogène, le processus de remplacement des clones dominants dans la population se produit très rapidement. Ainsi, après la diffusion dans la région de Moscou de la variété Domodedovsky, qui possède le gène de résistance R3, la fréquence des clones virulents pour cette variété est passée de 0,2 à 0,82 en un an (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Cependant, le changement des fréquences des gènes de virulence (pathotypes) dans les populations ne se produit pas seulement sous l'influence des variétés de pommes de terre cultivées. Par exemple, en Biélorussie jusqu'en 1977, les clones avec les gènes de virulence 1 et 4 dominaient, ce qui était dû à la culture de variétés de pommes de terre avec les gènes de résistance R1 et R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Cependant, à la fin des années 70 du 2002e siècle, des clones sont apparus avec différents gènes de virulence et leurs combinaisons, et les gènes de résistance complémentaires n'ont jamais été utilisés dans la sélection des pommes de terre (gènes de virulence supplémentaire) (Ivanyuk et al., XNUMX). La raison de l'apparition de tels clones est apparemment due à la migration vers l'Europe de matériel infectieux provenant du Mexique avec des tubercules de pomme de terre. À la maison, ces clones se sont développés non seulement sur des pommes de terre cultivées, mais aussi sur des espèces sauvages portant une variété de gènes de résistance; par conséquent, la combinaison de nombreux gènes de virulence dans le génome était nécessaire à la survie dans ces conditions.
Quant aux variétés à résistance non spécifique, elles, en réduisant le taux de reproduction du pathogène, retardent l'évolution de ses populations qui, comme déjà mentionné, est fonction du nombre. Etant donné que l'agressivité est polygénique, les clones contenant un plus grand nombre de gènes d '«agressivité» s'accumulent le plus tôt possible, plus la taille de la population est élevée. Par conséquent, les races très agressives ne sont pas le produit de l'adaptation aux variétés cultivées à résistance non spécifique, mais, au contraire, sont plus susceptibles d'être détectées dans les plantations de variétés très sensibles qui sont des accumulateurs des spores du parasite.
Ainsi, en Russie, les populations les plus agressives de P. Infestans ont été trouvées dans les zones d'épiphytoties annuelles (populations des régions de Sakhaline, Leningrad et Bryansk). L'agressivité de ces populations s'est avérée plus élevée que celle des populations mexicaines (Filippov et al., 2004).
De plus, moins d'oospores se forment dans les feuilles des variétés résistantes que chez celles sensibles (Hanson et Shattock, 1998), c'est-à-dire que la résistance non spécifique de la variété réduit également les capacités de recombinaison du parasite et la possibilité d'autres méthodes d'hivernage.
Influence des fongicides
Les fongicides réduisent non seulement le nombre de champignons phytopathogènes, c.-à-d. affectent les caractéristiques quantitatives de leurs populations, mais ils peuvent également modifier les fréquences des génotypes individuels, c.-à-d. influencer la composition qualitative des populations. Les indicateurs les plus importants de l'évolution des populations sous l'influence des fongicides sont les suivants: changements de résistance aux fongicides, changements d'agressivité et de virulence, et changements dans les systèmes reproducteurs.
Influence des fongicides sur la résistance et l'agressivité des populations
Le degré de cette influence est déterminé, tout d'abord, par le type de fongicide utilisé, qui peut être conditionnellement divisé en polysite, oligosite et monosite.
Le premier comprend la plupart des fongicides de contact. La résistance à eux (si cela est possible du tout) est contrôlée par un grand nombre de gènes très faiblement expressifs. Ces propriétés déterminent l'absence de changements visibles dans la résistance de la population après un traitement avec des fongicides (bien que dans certaines expériences une certaine augmentation de la résistance ait été obtenue). La population fongique préservée après pulvérisation avec des fongicides de contact se compose de deux groupes de souches:
1) Souches conservées dans les zones de plantes non traitées avec le médicament. Puisqu'il n'y a eu aucun contact avec le fongicide, l'agressivité et la résistance de ces souches ne changent pas.
2) Souches en contact avec le fongicide, dont la concentration aux points de contact était inférieure à la létalité. Comme mentionné ci-dessus, la résistance de cette partie de la population ne change pas non plus, cependant, en raison de l'effet dommageable partiel du fongicide même en concentration sublétale sur le métabolisme de la cellule fongique, l'aptitude générale et sa composante parasitaire, l'agressivité, la diminution (Derevyagina et Dyakov, 1990).
Ainsi, même une partie de la population non décédée, exposée au contact avec le fongicide, a une faible agressivité et ne peut pas être une source d'épiphytotiques. Par conséquent, un traitement soigneux qui réduit la fréquence de la proportion de la population non en contact avec le fongicide est une condition du succès des mesures de protection. La résistance aux fongicides oligosites est contrôlée par plusieurs gènes additifs.
La mutation de chaque gène entraîne une certaine augmentation de la résistance, et le degré global de résistance est dû à l'ajout de telles mutations. Par conséquent, l'augmentation de la résistance se produit par étapes. Les mutations de la résistance au fongicide diméthomorphe, qui est largement utilisé pour protéger les pommes de terre contre le mildiou, sont un exemple d'augmentation progressive de la résistance. La résistance au diméthomorphe est polygénique et additive. Une mutation en une étape augmente légèrement la résistance.
Chaque mutation ultérieure diminue la taille de la cible et, par conséquent, la fréquence des mutations ultérieures (Bagirova et al., 2001). L'augmentation de la résistance moyenne de la population après des traitements répétés avec un fongicide oligosite se produit par étapes et progressivement. La vitesse de ce processus est déterminée par au moins trois facteurs: la fréquence de mutation des gènes de résistance, le coefficient de résistance (le rapport de la dose létale d'une souche résistante par rapport à une souche sensible) et l'effet des mutations des gènes de résistance sur la fitness.
La fréquence d'apparition de chaque mutation ultérieure est inférieure à la précédente; par conséquent, le processus a un caractère amortissant (Bagirova et al., 2001). Cependant, si des processus de recombinaison (sexuels ou parasexuels) se produisent dans la population, il est alors possible de combiner différentes mutations des parents dans une souche hybride et d'accélérer le processus. Par conséquent, les populations panmix acquièrent une résistance plus rapidement que les populations agamiques, et dans ces dernières, les populations qui n'ont pas de barrières d'incompatibilité végétative plus rapidement que les populations séparées par de telles barrières. À cet égard, la présence de souches dans des populations qui diffèrent dans les types d'accouplement accélère le processus d'acquisition de la résistance aux fongicides oligosites.
Les deuxième et troisième facteurs ne contribuent pas à l'accumulation rapide de souches résistantes aux diméthomorphes dans les populations. Chaque mutation ultérieure double approximativement la résistance, ce qui est insignifiant, et réduit en même temps à la fois le taux de croissance dans un environnement artificiel et l'agressivité (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). C'est peut-être pourquoi il n'y a pratiquement pas de souches résistantes parmi les souches naturelles de P. infestans, même celles récoltées dans des plantations de pommes de terre traitées avec du diméthomorphe.
Une population traitée avec un fongicide oligosite sera également constituée de deux groupes de souches: celles qui n'ont pas été en contact avec le fongicide, et n'ont donc pas changé les caractères initiaux (si des souches résistantes sont trouvées dans ce groupe, elles ne s'accumuleront pas en raison de l'agressivité et de la compétitivité plus élevées des souches sensibles) et les souches en contact avec des concentrations sublétales du fongicide. C'est parmi ces derniers que l'accumulation de souches résistantes est possible, car ici elles présentent des avantages par rapport aux souches sensibles.
Par conséquent, lors de l'utilisation de fongicides oligosites, ce n'est pas tant un traitement approfondi qui est important qu'une concentration élevée du médicament, plusieurs fois supérieure à la dose létale, car avec la mutagenèse par étapes, la résistance initiale des souches mutées est faible.
Enfin, les mutations de résistance aux fongicides monosites sont très expressives, c'est-à-dire qu'une mutation peut signaler un niveau élevé de résistance jusqu'à une perte complète de sensibilité. Par conséquent, l'augmentation de la résistance des populations se produit très rapidement.
Un exemple de tels fongicides sont les phénylamides, y compris le fongicide le plus courant, le métalaxyl. Les mutations de résistance à celui-ci surviennent avec une fréquence élevée et le degré de résistance chez les mutants est très élevé - il dépasse la souche sensible d'un facteur mille ou plus (Derevyagina et al., 1993). Bien que le taux de croissance et l'agressivité des mutants résistants diminuent dans le contexte de la mort des souches sensibles d'un fongicide systémique, le nombre de la population résistante augmente rapidement et, en parallèle, son agressivité augmente. Par conséquent, après plusieurs années d'utilisation du fongicide, l'agressivité des souches résistantes peut non seulement égaler l'agressivité des souches sensibles, mais aussi la dépasser (Derevyagina et Dyakov, 1992).
Effet sur la recombinaison sexuelle
Étant donné que l'apparition fréquente du type d'accouplement A2 dans les populations de P. infestans coïncidait avec l'utilisation intensive du métalaxyl contre le mildiou, il a été suggéré que le métalaxyl induit une conversion du type d'accouplement. Chez P. parasitica, une telle conversion sous l'action du chloroneb et du métalaxyl a été prouvée expérimentalement (Ko, 1994). Un seul passage sur un milieu à faible concentration de métalaxyl a conduit à l'émergence d'isolats homothalliques d'une souche de P. infestans sensible au métalaxyl avec un type d'accouplement A1 (Savenkova et Cherepnikova-Anikina, 2002). Lors de passages ultérieurs sur des milieux avec une concentration plus élevée de métalaxyl, pas un seul isolat du type d'appariement A2 n'a été détecté, cependant, la plupart des isolats, lorsqu'ils sont croisés avec des isolats A2, au lieu des oospores, ont formé de vilaines accumulations de mycélium et étaient stériles. Les passages d'une souche résistante ayant le type d'accouplement A2 sur des milieux à forte concentration de métalaxyl nous ont permis de détecter trois formes de changements de type d'accouplement: 1) stérilité complète lorsqu'elle est croisée avec des isolats A1 et A2; 2) homotallisme (formation d'oospores en monoculture); 3) conversion du type d'accouplement A2 en A1. Ainsi, le métalaxyl peut provoquer des changements dans les types d'accouplement dans les populations de P. infestans et, par conséquent, la survenue d'une recombinaison sexuelle chez celles-ci.
Influence sur la recombinaison végétative
Certains gènes de résistance aux antibiotiques ont augmenté la fréquence de l'hétérocaryotisation hypale et de la diploïdisation nucléaire (Poedinok et Dyakov, 1981). Comme indiqué précédemment, l'hétérocaryotisation des hyphes lors de la fusion de différentes souches de P. infestans se produit très rarement en raison du phénomène d'incompatibilité végétative chez ce champignon. Cependant, les gènes de résistance à certains antibiotiques peuvent avoir des effets secondaires, exprimés en surmontant l'incompatibilité végétative. Cette propriété était possédée par le gène de résistance à la streptomycine mutant 1S-1. La présence de tels mutants dans les populations de terrain de phytophthora peut augmenter le flux de gènes entre les souches et accélérer l'adaptation de l'ensemble de la population à de nouvelles variétés ou fongicides.
Certains fongicides et antibiotiques peuvent influencer la fréquence de la recombinaison mitotique, ce qui peut également modifier les fréquences génotypiques dans les populations. Le fongicide bénomyl largement utilisé se lie à la bêta-tubuline, une protéine à partir de laquelle les microtubules du cytosquelette sont construits, et perturbe ainsi les processus de séparation des chromosomes dans l'anaphase de la mitose, augmentant la fréquence de la recombinaison mitotique (Hastie, 1970).
Le fongicide para-fluorophénylalanine, utilisé pour traiter la maladie hollandaise des ormes, a la même propriété. La para-fluorophénylalanine a augmenté la fréquence de recombinaison chez les diploïdes hétérozygotes P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Modifications cycliques de la composition génotypique des populations dans le cycle de vie de P. infestans
Le cycle de développement classique de P. infestans dans la zone tempérée comprend 4 phases.
1) Phase de croissance exponentielle de la population (phase polycyclique) avec des générations courtes. Cette phase commence généralement en juillet et dure 1,5 à 2 mois.
2) La phase d'arrêt de la croissance de la population due à une forte diminution de la proportion de tissus non affectés ou à l'apparition de conditions météorologiques défavorables. Cette phase dans les exploitations qui effectuent une élimination précoce des feuilles avant la récolte sort du cycle annuel.
3) La phase d'hivernage des tubercules, accompagnée d'une diminution significative de la taille de la population due à une infection accidentelle des tubercules, du développement lent de l'infection dans ceux-ci, de l'absence de réinfection des tubercules, de la pourriture et de l'abattage des tubercules atteints dans des conditions normales de stockage.
4) La phase de développement lent dans le sol et sur les semis (phase monocyclique), dans laquelle la durée de génération peut atteindre un mois ou plus (fin mai - début juillet). Habituellement, à ce moment, les feuilles malades sont difficiles à détecter, même avec des observations spéciales.
Phase de croissance démographique exponentielle (phase polycyclique)
De nombreuses observations (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) ont montré qu'au début de l'épiphytotie, prédominent les clones faiblement virulents et légèrement agressifs, qui sont ensuite remplacés par des clones plus virulents et agressifs. le taux de croissance de l'agressivité de la population est d'autant plus élevé que la variété de la plante hôte est moins résistante.
À mesure que la population augmente, la concentration des gènes sélectivement importants introduits dans les variétés commerciales (R1-R4) et sélectivement neutres (R5-R11) augmente. Ainsi, dans les populations proches de Moscou en 1993, la virulence moyenne de fin juillet à mi-août est passée de 8,2 à 9,4, et la plus forte augmentation a été observée pour le gène de virulence sélectivement neutre R5 (de 31 à 86% des clones virulents) (Smirnov, 1996 ).
Une diminution du taux de croissance d'une population s'accompagne d'une diminution de l'activité parasitaire de la population. Par conséquent, dans les années dépressives, le nombre total de races et la proportion de races hautement virulentes sont inférieurs à ceux des races épiphytotiques (Borisenok, 1969). Si, au plus fort de l'épiphytose, les conditions météorologiques deviennent défavorables au mildiou et que l'infestation des pommes de terre diminue, la concentration de clones hautement virulents et agressifs diminue également (Rybakova et al., 1987).
L'augmentation de la fréquence des gènes affectant la virulence et l'agressivité de la population peut être due à la sélection de clones plus virulents et agressifs dans la population mixte. Pour démontrer la sélection, une méthode d'analyse des mutations neutres a été développée, qui a été utilisée avec succès dans des populations de chimiostats de levure (Adams et al., 1985) et de Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
La fréquence des mutants résistants à la blasticidine S dans la population de terrain de P. infestans a diminué parallèlement à la croissance de l'agressivité de la population, ce qui indique un changement des clones dominants dans le processus de croissance de la population (Rybakova et al., 1987).
Phase d'hivernage dans les tubercules
Lors de l'hivernage dans les tubercules de pomme de terre, la virulence et l'agressivité des souches de P. infestans diminuent et la diminution de la virulence se produit plus lentement que l'agressivité (Rybakova et Dyakov, 1990). Apparemment, dans des conditions propices à la croissance rapide de la population (r-sélection), des gènes de virulence «extra» et une forte agressivité sont utiles, donc le développement d'épiphytotiques s'accompagne de la sélection des clones les plus virulents et agressifs. Dans des conditions de saturation de l'environnement, quand ce n'est pas le taux de reproduction, mais la persistance de l'existence dans des conditions défavorables (sélection K) joue un rôle important, les gènes «supplémentaires» de virulence et d'agressivité réduisent la forme physique, et les clones avec ces gènes sont les premiers à s'éteindre, de sorte que l'agressivité moyenne et la virulence de la population diminue.
Phase de végétation dans le sol
Cette phase est la plus mystérieuse du cycle de vie (Andrivon, 1995). Son existence a été postulée de manière purement spéculative - en raison du manque d'informations sur ce qui arrive à l'agent pathogène sur une longue période (parfois plus d'un mois) - depuis l'émergence des plants de pommes de terre jusqu'à l'apparition des premières taches de la maladie sur eux. Sur la base d'observations et d'expériences, le comportement du champignon à cette période de la vie a été reconstruit (Hirst et Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
La sporulation du champignon peut se former sur les tubercules infectés dans le sol. Les spores qui en résultent germent avec des hyphes, qui peuvent végéter longtemps dans le sol. Les spores primaires (formées sur les tubercules) et secondaires (sur le mycélium dans le sol) remontent à la surface du sol par des courants capillaires, mais acquièrent la capacité d'infecter les pommes de terre seulement après que ses feuilles inférieures soient descendues et entrent en contact avec la surface du sol. De telles feuilles (à savoir, les premières taches de la maladie se trouvent sur elles) ne se forment pas immédiatement, mais après une croissance et un développement prolongés des pommes de terre.
Ainsi, dans le cycle de vie de P. infestans, la phase de végétation saprotrophique peut également exister. Si dans la phase parasitaire du cycle de vie, l'agressivité est la composante la plus importante de la forme physique, alors dans la phase saprotrophique, la sélection vise à réduire les propriétés parasites, comme cela a été démontré expérimentalement pour certains champignons phytopathogènes (voir Carson, 1993). Par conséquent, dans cette phase du cycle, les propriétés agressives devraient être perdues le plus intensément. Mais jusqu'à présent, aucune expérience directe n'a été menée pour confirmer les hypothèses ci-dessus.
Les changements saisonniers affectent non seulement les propriétés pathogènes de P. infestans, mais aussi la résistance aux fongicides, qui se développe dans la phase polycyclique (pendant les épiphytoties) et diminue pendant le stockage hivernal (Derevyagina et al., 1991; Kadish et Cohen, 1992). Une baisse particulièrement intense de la résistance au métalaxyl a été observée entre la plantation des tubercules atteints et l'apparition des premières taches de la maladie au champ.
Spécialisation intraspécifique et son évolution
P. infestans provoque des épidémies dans deux cultures d'importance commerciale, la pomme de terre et la tomate. Les épiphytoties sur les pommes de terre ont commencé peu de temps après l'entrée du champignon dans de nouvelles zones. La défaite de la tomate a également été notée peu de temps après l'apparition de l'infection sur les pommes de terre, mais des épiphytoties sur la tomate n'ont été notées que cent ans plus tard - au milieu du XXe siècle. Voici ce que Hallegli et Niederhauser écrivent sur la défaite de la tomate aux USA
(1962): «Pendant environ 100 ans après l'épiphytotie sévère de 1845, peu ou presque aucune tentative n'a été faite pour obtenir des variétés résistantes de tomates. Bien que le mildiou ait été signalé pour la première fois sur les tomates dès 1848, il n'a fait l'objet d'une attention particulière de la part des sélectionneurs sur cette plante qu'à une forte épidémie de la maladie en 1946. Sur le territoire de la Russie, le mildiou de la tomate a été enregistré au 60ème siècle. «Pendant longtemps, les chercheurs n'ont pas prêté attention à cette maladie, car elle n'a pas causé de dommages économiques importants. Mais dans les années 70 et 1979. Des épiphytoties du mildiou du XXe siècle sur la tomate sont observées en Union soviétique, principalement dans la région de la Basse Volga, en Ukraine, dans le Caucase du Nord, en Moldavie ... »(Balashova, XNUMX).
Depuis lors, le mildiou de la tomate est devenu annuel, s'est répandu sur tout le territoire de la culture industrielle et domestique et a causé d'énormes dommages économiques à cette culture. Qu'est-il arrivé? Pourquoi la première apparition du parasite sur la pomme de terre et la lésion épiphytotique de cette culture se sont-elles produites presque simultanément, alors qu'il a fallu un siècle pour que l'épiphytose apparaisse sur la tomate? Ces différences favorisent une source d'infection mexicaine plutôt qu'une source sud-américaine. Si l'espèce Phytophthora infestans s'est formée en tant que parasite des espèces mexicaines à tubercules du genre Solanum, alors on comprend pourquoi les pommes de terre cultivées appartenant à la même section du genre que l'espèce mexicaine ont été si fortement affectées, mais en raison de l'absence de coévolution avec le parasite, qui n'a pas développé de mécanismes de résistance spécifique et non spécifique.
La tomate appartient à une section différente du genre, le type de son échange présente des différences significatives par rapport aux espèces tubéreuses.Par conséquent, malgré le fait que la tomate ne soit pas en dehors de la spécialisation alimentaire de P. infestans, l'intensité de sa défaite était insuffisante pour de graves pertes économiques.
L'émergence d'épiphytoties sur la tomate est due à de graves modifications génétiques du parasite, qui ont augmenté son adaptabilité (pathogénicité) lorsqu'il est parasité. Nous pensons que la nouvelle forme spécialisée pour parasiter la tomate est la race T1 décrite par M. Gallegly, affectant les variétés de tomates cerises (Red Cherry, Ottawa), résistantes à la race T0 répandue sur les pommes de terre (Gallegly, 1952). Apparemment, une mutation (ou une série de mutations) qui a transformé la race T0 en race T1 et a conduit à l'apparition de clones très adaptés à la défaite de la tomate. Comme cela arrive souvent, une augmentation de la pathogénicité pour un hôte s'est accompagnée de sa diminution chez un autre, c'est-à-dire qu'une spécialisation intraspécifique initiale, pas encore complète, s'est produite - aux pommes de terre (race T0) et à la tomate (race T1).
Quelle est la preuve de cette hypothèse?
- Présence sur les pommes de terre et les tomates. Sur les feuilles de tomate, la race T1 prédomine, tandis que sur les feuilles de pomme de terre, elle est rare. Selon S.F.Bagirova et T.A. Oreshonkova (non publié) dans la région de Moscou en 1991-1992, la présence de la race T1 dans les plantations de pommes de terre était de 0% et dans les plantations de tomates - 100%; en 1993-1995 - 33% et 90%, respectivement; en 2001 - 0% et 67%. Des données similaires ont été obtenues en Israël (Cohen, 2002). Des expériences d'infection de tubercules de pomme de terre avec des isolats de la race T1 et un mélange d'isolats T0 et T1 ont montré que les isolats de la race T1 sont mal conservés dans les tubercules et sont remplacés par des isolats de la race T0 (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamique de la race T1 dans les plantations de tomates. La primo-infection des feuilles de tomate est réalisée par des isolats de la race T0, qui dominent dans l'analyse de l'infection dans les premières taches formées sur les feuilles. Ceci confirme le schéma généralement accepté de la migration parasitaire: la masse principale d'infection à partir de la pomme de terre est constituée de la race T0, cependant, un petit nombre de clones T1 conservés dans la pomme de terre, une fois sur la tomate, déplacent la race T0 et s'accumulent vers la fin de la période épiphytotique. Il est également possible qu'il existe une source alternative d'infection des feuilles de tomate avec la race T1, pas aussi puissante que les tubercules et les feuilles de pomme de terre, mais constante. Par conséquent, cette source a un faible effet sur la structure génétique de la population infectant la tomate, mais détermine par la suite l'accumulation de la race T1 (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agressivité envers les pommes de terre et les tomates. L'infection artificielle des feuilles de tomate et de pomme de terre avec des isolats des races T0 et T1 a montré que les premiers sont plus agressifs pour les pommes de terre que pour les tomates, et les seconds sont plus agressifs pour les tomates que pour les pommes de terre. Ces différences se manifestent par le déplacement d'isolats d'une race non «propre» d'une population mixte lors de passages sur feuilles en serre (Dyakov et al., 1975) et en parcelles (Leberton et al., 1999); les différences dans la charge infectieuse minimale, la période de latence, la taille des taches infectieuses et la production de spores (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al., 1999; Leberton et al. al., 2000; Vega-Sanchez et al., 2002; Knapova, Gisi, 2004; Sussuna et al., XNUMX).
L'agressivité des isolats de la race T1 vis-à-vis des cultivars de tomates dépourvus de gènes de résistance est si élevée que ces isolats sporent sur les feuilles comme sur un milieu nutritif sans nécroser le tissu infecté (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulence pour les pommes de terre et les tomates. La race T1 affecte les variétés de tomates cerises avec le gène de résistance Ph1, tandis que la race T0 n'est pas capable d'infecter ces variétés, i.e. a une virulence plus étroite. Par rapport aux différenciateurs
Les gènes R des pommes de terre sont inversement liés, c'est-à-dire les souches isolées à partir de feuilles de tomates sont moins virulentes que les souches «pomme de terre» (tableau 11).
5) Marqueurs neutres. L'analyse des marqueurs neutres dans les populations de P. infestans parasitant les pommes de terre et les tomates témoigne également de la sélection intraspécifique multidirectionnelle. Dans les populations brésiliennes de P. infestans, les isolats de feuilles de tomate appartenaient à la lignée clonale US-1 et ceux des feuilles de pomme de terre à la lignée BR-1 (Suassuna et al., 2004). En Floride (USA), depuis 1994, le clone US-90 a commencé à dominer sur les pommes de terre (avec une occurrence de plus de 8%), et les clones US-11 et US-17 sur la tomate, et les isolats de ces derniers sont plus agressifs pour la tomate que pour la pomme de terre (Weingartner , Tombolato, 2004). Des différences significatives de fréquences génotypiques (empreintes ADN) dans les isolats de pomme de terre et de tomate ont été établies pour 1200 souches de P. infestans collectées aux États-Unis de 1989 à 1995 (Deahl et al., 1995).
L'utilisation de la méthode AFLP a permis de séparer 74 souches prélevées sur des feuilles de pomme de terre et de tomate en 1996-1997. en France et en Suisse, en 7 groupes. Les souches de pomme de terre et de tomate ne différaient pas clairement, mais les souches «pomme de terre» étaient génétiquement plus diversifiées que celles «tomate». Les premiers ont été trouvés dans les sept grappes, et les seconds, seulement dans quatre, ce qui indique un génome plus spécialisé du second (Knapova et Gisi, 2002).
6) Mécanismes d'isolement. Si les populations du parasite sur deux espèces de plantes hôtes évoluent vers un rétrécissement de la spécialisation vers leur «propre» hôte, alors divers mécanismes pré- et postméiotiques apparaissent qui empêchent les échanges génétiques interpopulation (Dyakov et Lekomtseva, 1984).
Plusieurs études ont étudié l'effet de la source des souches parentales sur l'efficacité de l'hybridation. Lorsque des souches isolées de différentes espèces du genre Solanum ont été croisées en Equateur (Oliva et al., 2002), il a été constaté que les souches avec le type d'accouplement A2 de morelles sauvages (lignée clonale EC-2) croisaient les plus mauvaises avec les souches de tomate (lignée EC -3), et le plus efficacement croisé avec la souche de pomme de terre (EC-1).
Tous les hybrides se sont révélés non pathogènes. Les auteurs pensent que le faible pourcentage d'hybridation et la réduction de la pathogénicité chez les hybrides sont dus à des mécanismes postméiotiques d'isolement reproductif des populations.
Dans les expériences de Bagirova et al. (1998), un grand nombre de souches de pomme de terre et de tomate ont été croisées avec les propriétés des races T0 et T1. Les croisements les plus fertiles de souches T1xT1 isolées de la tomate (36 oospores dans le champ de vision du microscope, 44% de germination des oospores), les moins efficaces étaient des croisements de races T0xT1 isolées à partir de différents hôtes (un faible nombre d'oospores en développement et germées, une forte proportion d'oospores abortives et sous-développées) ... L'efficacité des croisements entre isolats de la race T0 isolés à partir de pommes de terre était intermédiaire. Étant donné que le corps principal des souches de la race T0 affecte les pommes de terre, il s'agit d'une source fiable d'hivernage - les tubercules de pomme de terre, ce qui fait que l'importance des oospores en tant qu'unités infectieuses d'hivernage pour les populations de pommes de terre est faible. La «forme tomate» adaptée est capable d'hiverner sur la tomate sous forme d'oospores (voir ci-dessous) et conserve donc une productivité plus élevée du processus sexuel. En raison de sa fertilité élevée, T1 acquiert un potentiel indépendant de primo-infection chez la tomate. Les résultats obtenus par Knapova et al. (Knapova et al., 2002) peuvent être interprétés de la même manière. Les croisements de souches isolées de pommes de terre avec des souches de tomates ont donné le plus grand nombre d'oospores - 13,8 par mm5. moyen (avec un étalement de 19-6,3) et un pourcentage intermédiaire de germination des oospores (0 avec un étalement de 24-7,6). Les croisements de souches isolées à partir de tomates ont donné le plus faible pourcentage d'oospores (4 avec une propagation de 12 à 10,8) avec le pourcentage le plus élevé de leur germination (8,6). Les croisements entre les souches isolées de pommes de terre ont donné un nombre intermédiaire d'oospores (0 avec une forte dispersion des données - 30-2,7) et le plus faible pourcentage de germination des oospores (90). Ainsi, les souches de pommes de terre sont moins fertiles que celles de tomates, mais les croisements interpopulation n'ont pas donné de pires résultats que ceux d'intrapopulation. Il est possible que les différences avec les données ci-dessus de Bagirova et al. s'expliquent par le fait que des chercheurs russes ont travaillé avec des souches isolées au début des années 90 du XNUMXe siècle, et des chercheurs suisses - avec des souches isolées à la fin des années XNUMX.
L'hétéroploïdie des souches peut être à l'origine d'une faible fertilité. Si dans les populations mexicaines, où le processus sexuel et la primo-infection avec la progéniture oosporeuse sont réguliers, la plupart des souches étudiées de P. Infestans sont diploïdes, alors dans les pays de l'Ancien Monde on observe un polymorphisme intrapopulation de la ploïdie (souches di-, tri- et tétraploïdes, ainsi que souches hétérocaryotes à noyaux hétéropoïdes) , et les souches ayant différents types d'accouplement, c.-à-d. mutuellement fertiles, diffèrent par la ploïdie nucléaire (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). La diversité des noyaux des anthéridies et des oogonies peut être à l'origine d'une faible fertilité.
Quant aux échanges nucléaires entre hyphes lors des anastomoses, ils sont empêchés par l'incompatibilité végétative, qui divise les populations asexuées en de nombreux clones génétiquement isolés (Poedinok et Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Convergence des populations. Les données ci-dessus indiquent que l'hybridation entre les souches de P. infestans «pomme de terre» et «tomate» est possible. Une réinfection réciproque de différents hôtes est également possible, mais avec une agressivité réduite.
Une étude des marqueurs de population dans des isolats provenant de champs de pommes de terre et de tomates adjacents en 1993 a montré qu'environ un quart des isolats isolés de feuilles de tomates avaient été transférés d'un champ de pommes de terre voisin (Dolgova et al., 1997). Théoriquement, on pourrait supposer que la divergence des populations sur deux hôtes augmentera et conduira à l'émergence de formes intraspécifiques spécialisées (f.sp. pomme de terre et f.sp. tomate), d'autant plus que les oospores peuvent persister dans les résidus végétaux (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) et des graines de tomates (Rubin et al., 2001). Par conséquent, les tomates ont actuellement une source de régénération printanière indépendante des tubercules de pomme de terre.
Cependant, tout s'est passé différemment. L'hivernage avec des oospores a permis au parasite d'éviter le stade le plus étroit de son cycle de vie - le stade monocyclique de la végétation dans le sol, au cours duquel les propriétés parasitaires diminuent, qui sont progressivement restaurées dans la phase polycyclique en été.
Tableau 11. Fréquences des gènes de virulence aux variétés de différenciation de la pomme de terre dans les souches de P. infestans
pays | année | Nombre moyen de gènes de virulence dans les souches | auteur | |
de pommes de terre | de la tomate | |||
France | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et coll., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
France, Suisse | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gissi, 2002 |
Etats-Unis | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et coll., 1995 |
États-Unis, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Equateur | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israël | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Russie, Mosk. Région | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Russie, différentes régions | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya et autres. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Les zoosporanges et zoospores primaires, qui germent les oospores, ont un degré élevé d'activité parasitaire, surtout si les oospores ont été formées de manière parthénogénétique sous l'influence des phéromones d'une souche avec le type d'accouplement opposé. Par conséquent, le matériel infectieux sur les plants de tomates cultivés à partir de graines infectées par des oospores est hautement pathogène pour la tomate et la pomme de terre.
Ces changements ont conduit à une autre restructuration de la population, exprimée par les changements importants suivants d'un point de vue épidémiologique:
- Les plants de tomates infectés sont devenus une source importante de primo-infection des pommes de terre (Filippov, Ivanyuk, messages personnels).
- Des épiphytoties sur les pommes de terre ont commencé à être observées dès juin, environ un mois plus tôt que d'habitude.
- Dans les plantations de pommes de terre, le pourcentage de la race T1 a augmenté, ce que l'on y rencontrait auparavant en quantité insignifiante (Ulanova et al., 2003).
- Les souches isolées à partir de feuilles de tomates ont cessé de différer des souches de pommes de terre en virulence sur les différentiateurs de pommes de terre des gènes de virulence et ont commencé à surpasser les souches de pommes de terre en agressivité non seulement sur la tomate, mais aussi sur les pommes de terre (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Ainsi, au lieu de divergence, il y a eu une convergence des populations, l'émergence d'une seule population sur deux plantes hôtes à forte virulence et agressivité envers les deux espèces.
Conclusion
Ainsi, malgré plus de 150 ans d'étude intensive de P. infestans, en biologie, y compris la biologie de la population de cet agent causal des maladies les plus importantes des plantes solanacées cultivées, beaucoup reste inconnu. On ne sait pas comment le passage des étapes individuelles du cycle de vie affecte la structure des populations, quels sont les mécanismes génétiques de la variabilité canalisée de l'agressivité et de la virulence, quel est le rapport des systèmes de reproduction reproductrice et clonale dans les populations naturelles, comment l'incompatibilité végétative est héritée, quel est le rôle des pommes de terre et des tomates dans l'infection primaire de ces cultures et dans quel est leur effet sur la structure des populations de parasites. Jusqu'à présent, des problèmes pratiques aussi importants que les mécanismes génétiques permettant de modifier l'agressivité du parasite ou l'érosion de la résistance non spécifique de la pomme de terre n'ont pas été résolus. Avec l'approfondissement et l'expansion de la recherche sur le mildiou de la pomme de terre, le parasite pose de nouveaux défis aux chercheurs. Cependant, l'amélioration des capacités expérimentales, l'émergence de nouvelles approches méthodologiques de la manipulation avec des gènes et des protéines nous permettent d'espérer une solution réussie des questions posées.
L'article a été publié dans la revue "Potato Protection" (n ° 3, 2017)